[自然科學(xué)]第九章 蛋白質(zhì)的測(cè)定ppt課件

1、第九章第九章 蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定王建龍王建龍食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院第九章第九章 重點(diǎn)重點(diǎn) 凱氏定氮法原理、分步、測(cè)定方法。凱氏定氮法原理、分步、測(cè)定方法。 雙縮脲法測(cè)定原理。雙縮脲法測(cè)定原理。 氨基酸總量的測(cè)定方法甲醛滴定法。氨基酸總量的測(cè)定方法甲醛滴定法。一、概述1、食品中的蛋白質(zhì)含量 各種不同食品的蛋白質(zhì)含量各不一樣，普通動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。 食品中的蛋白質(zhì)含量食品中的蛋白質(zhì)含量(g/100g)牛肉 豬肉 兔肉 雞肉 20 9.5 21 20大豆 米 面粉 菠菜 蘋(píng)果 40 8.5 10 2.4 0.42、蛋白質(zhì)的生理功用及在食品中的作用3、蛋白質(zhì)系數(shù)

2、 蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，普通蛋白質(zhì)含氮量為16，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值6.25稱(chēng)為蛋白質(zhì)系數(shù)，不同種類(lèi)食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同。樣品蛋白質(zhì)系數(shù)樣品蛋白質(zhì)系數(shù)小麥粉及其制品5.70畜禽肉及其制品6.25全麥5.83芝麻5.30大米5.95乳類(lèi)6.38花生5.46黃豆5.71二、測(cè)定方法蛋白質(zhì)測(cè)定方法凱氏定氮法蛋白質(zhì)快速測(cè)定法一凱氏定氮法一凱氏定氮法GB/T 5009.5-2003) 凱氏定氮法是經(jīng)過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量凱氏定氮法是經(jīng)過(guò)測(cè)出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含量，由于樣品

3、中含有少量非蛋白質(zhì), ,用凱用凱氏定氮法經(jīng)過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量，氏定氮法經(jīng)過(guò)測(cè)總氮量來(lái)確定蛋白質(zhì)含量，包含了核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉、包含了核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測(cè)定結(jié)果稱(chēng)為粗蛋白。所以這樣的測(cè)定結(jié)果稱(chēng)為粗蛋白。The Kjeldahl Procedure凱氏法的程序凱氏法的程序 1. Digestion step消化2. Distillation step蒸餾3. Titration step滴定1、原理 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+1

4、6H2O 消化 (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 蒸餾滴定 4225)(5)(423342742427424333BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又具有氧化性氮。濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后的碳化為二將有機(jī)物炭化后的碳化為二氧化碳，硫酸那么被復(fù)原成二氧化硫。氧化碳，硫酸那么被復(fù)原成二氧化硫。 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO22、儀器凱氏燒瓶、可調(diào)式電爐、蒸汽蒸餾安裝3、試劑1硫酸銅CuSO45H2O；2硫酸鉀；3濃硫酸:

5、密度為1.8419 g/L4氫氧化鈉溶液:400g/L5)硼酸溶液:20g/L6 6 0.05 mol 0.05 molL L鹽酸規(guī)范滴定溶液鹽酸規(guī)范滴定溶液 7 795%95%乙醇。乙醇。8 8混合指示液混合指示液:1:1份甲基紅乙醇溶液份甲基紅乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)與與5 5份溴甲酚綠乙醇溶液份溴甲酚綠乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)臨用時(shí)混合。也可臨用時(shí)混合。也可用用2 2份甲基紅乙醇溶液份甲基紅乙醇溶液(1 g/L)(1 g/L)與與1 1份亞甲基藍(lán)乙份亞甲基藍(lán)乙醇溶液醇溶液(1 g/L)(1 g/L)臨用時(shí)混合。臨用時(shí)混合。甲基紅-溴甲酚綠 pH 5.0 以下為暗紅

6、色，pH 5.1 為灰綠色， pH 5.2 以上為綠色。 甲基紅-亞甲基藍(lán)混合指示液： 變色點(diǎn)pH=5.4，5.2紅紫5.4灰藍(lán)5.6綠， 4、操作方法 樣品消化蒸餾滴定1樣品消化樣品+0.2g硫酸銅+6g硫酸鉀+20ml濃硫酸+玻珠數(shù)粒先小火炭化，無(wú)泡沫后，加大火力，液體變藍(lán)綠透明，繼續(xù)加熱微沸30分鐘45度角消化終點(diǎn)瓶口不能對(duì)著人蓋上小漏斗2 2蒸餾蒸餾按以下圖銜接好蒸餾安裝圖加水至2/3體積處，加數(shù)滴甲基橙指示劑和硫酸幾毫升，使水呈酸性?shī)A緊螺旋夾加熱蒸汽發(fā)生瓶中的水，檢查整套安裝能否有漏氣景象，不能漏氣。水蒸氣與生成的氨氣共沸，不斷移除氨氣，使反響繼續(xù)。2 2蒸餾蒸餾將消化液全部轉(zhuǎn)移到1

7、00ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示劑23d參與NaOH溶液后顏色為深藍(lán)色或褐色通入蒸汽開(kāi)場(chǎng)蒸餾冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀釋液沿小玻璃杯移入反響室，少量蒸餾水沖洗，塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)參與10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH緩慢流入反響室，立刻塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。吸收液變藍(lán)色后繼續(xù)蒸餾5分鐘，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端，取下接納瓶，封鎖電源3 3滴定滴定 取下接納瓶，用取下接納瓶，用0.1000mol/L0.1000mol/L的鹽酸或硫的鹽酸或硫酸規(guī)范溶液滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。酸規(guī)范溶液滴定至灰色或

8、藍(lán)紫色為終點(diǎn)。滴定前滴定終點(diǎn)同時(shí)做一試劑空白實(shí)驗(yàn)，記錄空白滴定耗費(fèi)鹽酸的體積。5、計(jì)算10010010014. 0)(=%2-1FmVVc）蛋白質(zhì)（0.014表示表示1.0鹽酸規(guī)范滴定溶液相當(dāng)?shù)暮葵}酸規(guī)范滴定溶液相當(dāng)?shù)暮縁表示蛋白質(zhì)系數(shù)表示蛋白質(zhì)系數(shù)計(jì)算結(jié)果保管三位有效數(shù)字計(jì)算結(jié)果保管三位有效數(shù)字6、闡明及本卷須知1 試劑溶液運(yùn)用無(wú)氨蒸餾水配制2消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)堅(jiān)持緩和沸騰，消化中不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固體殘?jiān)龠M(jìn)其消化完全。3為加速消化，常參與 硫酸鉀：可提高消化體系溶液溫度 硫酸銅：催化劑、消化終點(diǎn)指示劑、蒸餾時(shí)堿性反響指示劑硫酸鉀的作用硫酸鉀的作用

9、參與硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸參與硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反響溫度其反響式如下：作用生成硫酸氫鉀可提高反響溫度其反響式如下： K2SO4+H2SO4=2KHSO4 K2SO4+H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3普通純硫酸的沸點(diǎn)在普通純硫酸的沸點(diǎn)在340340攝氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫?cái)z氏度左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高到度提高到4000C4000C以上，緣由主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地被分以上，緣由主要在于隨著消化過(guò)程中硫酸不斷地

10、被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大 ，故沸點(diǎn)升高。，故沸點(diǎn)升高。但硫酸鉀參與量不能太大，否那么消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起但硫酸鉀參與量不能太大，否那么消化體系溫度過(guò)高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而呵斥損失：已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而呵斥損失： NH4NH42SO4=NH3+(NH4)HSO42SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O硫酸銅的作用硫酸銅的作用 催化劑催化劑 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 CO2+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2

11、 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反響不斷進(jìn)展，待有機(jī)物被消化完后，此反響不斷進(jìn)展，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。清澈的藍(lán)綠色。 可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá) 下一步蒸餾時(shí)作為堿性反響的指示劑。下一步蒸餾時(shí)作為堿性反響的指示劑。4樣品中假設(shè)含較多脂肪或糖，在開(kāi)場(chǎng)消化時(shí)運(yùn)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者參與少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)留意控制熱源強(qiáng)度。5當(dāng)樣品消化液不易廓清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，參與30%過(guò)氧化氫23ml后再繼續(xù)加熱消化。 6假設(shè)取樣量較大，如干試樣超越5g

12、，可按每克試樣5ml的比例添加硫酸用量。 7普通消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，普通消化時(shí)間約4小時(shí)，時(shí)間延伸能夠引起氨的損失。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 8蒸餾安裝不能漏氣9蒸餾前假設(shè)加堿量缺乏，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，需再添加氫氧化鈉用量10硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超越40，否那么對(duì)氨的吸收作用減弱，置于冷水浴中運(yùn)用。11蒸餾終了后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面,清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源，否那么能夠呵斥吸收液倒吸。7、自動(dòng)凱氏定氮儀法 在凱氏定氮法的根底上開(kāi)展起來(lái)的自動(dòng)凱氏定氮儀法，具有平安、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。儀器：消化爐自動(dòng)蒸餾安裝FO

13、SS 產(chǎn)品線產(chǎn)品線化學(xué)分析儀器化學(xué)分析儀器化學(xué)分析類(lèi)儀器：化學(xué)分析類(lèi)儀器：Kjeltec系列定氮儀系列定氮儀FOSS 產(chǎn)品線產(chǎn)品線化學(xué)分析儀器化學(xué)分析儀器化學(xué)分析類(lèi)儀器：化學(xué)分析類(lèi)儀器：Tecator系列消化系列消化器器Digestion Blocks消化爐Auto 20 and Auto 8250/400ml. 和100ml. Basic 20 and Basic 8250/400ml和100mlNewAuto 40100mlLift, Exhaust Manifold and Scrubber消化爐、升降安裝、排廢罩和滌氣安裝消化爐、升降安裝、排廢罩和滌氣安裝New generation

14、of Kjeltec Systems新一代凱氏定氮儀新一代凱氏定氮儀-前所未有的智能化系統(tǒng)！前所未有的智能化系統(tǒng)！ 8200 8400半自動(dòng)半自動(dòng) -到到- 全自動(dòng)全自動(dòng)8100 8400/8420或或8460NewKjeltecTM 8100 凱氏定氮儀自動(dòng)添加稀釋液和堿，自動(dòng)進(jìn)展蒸餾和終了蒸餾，自動(dòng)進(jìn)展消化管排空，操作簡(jiǎn)便。專(zhuān)利的SAfE*技術(shù)保證在消化管中有酸/鹽結(jié)晶時(shí)的平安蒸餾。 內(nèi)置的平安系統(tǒng)保證操作者的平安。 餾出液的溫度控制系統(tǒng)保證分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。 風(fēng)箱泵準(zhǔn)確添加試劑，保證準(zhǔn)確性。KjeltecTM 8200 凱氏定氮儀包含KjeltecTM 8100 一切的特征，另加：自動(dòng)添

15、加接納液自動(dòng)平安門(mén)可添加模塊晉級(jí)到全自動(dòng)凱氏定氮儀KjeltecTM 8400 全自動(dòng)凱氏定氮儀包括 KjeltecTM 8200的一切特征，外加： 滴定、計(jì)算和報(bào)告?？蓵x級(jí)和20或60位自動(dòng)進(jìn)樣器連用，進(jìn)展無(wú)人值守的全自動(dòng)化操作。局域網(wǎng)銜接方式可以和打印機(jī)及天平進(jìn)展無(wú)妨礙銜接。彩色觸摸屏。經(jīng)過(guò)可選計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)管理軟件Compass實(shí)現(xiàn)完全由計(jì)算機(jī)控制樣品注冊(cè)和報(bào)告。KjeltecTM 8420 自動(dòng)進(jìn)樣器20位自動(dòng)進(jìn)樣器，可包容一個(gè)20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系統(tǒng)將消化管架直接裝入進(jìn)樣器，不需求轉(zhuǎn)移消化管或消化好的樣品KjeltecTM 8460 自動(dòng)進(jìn)樣器 60位自動(dòng)進(jìn)

16、樣器，可包容3個(gè)20位消化管架 250ml和400ml消化管都可用于系統(tǒng) 將消化管架直接裝入進(jìn)樣器，不需求轉(zhuǎn)移消化管或消化好的樣品KjeltecTM 自動(dòng)進(jìn)樣器可選20 & 60位進(jìn)樣器直接將消化管架放入，不需轉(zhuǎn)移消化管或轉(zhuǎn)移樣品250 ml和 400 ml管都可用于系統(tǒng)Kjeltec 8400 自動(dòng)定氮儀可以直接晉級(jí)Kjeltec 8200 也可以晉級(jí)到加進(jìn)樣器的分析系統(tǒng)Kjeltec 8420Kjeltec 8460其它廠家的不能晉級(jí)或不能直接晉級(jí)其它廠家的不能晉級(jí)或不能直接晉級(jí)銜接進(jìn)樣器，且需轉(zhuǎn)移消化管或消化銜接進(jìn)樣器，且需轉(zhuǎn)移消化管或消化管內(nèi)的樣品管內(nèi)的樣品儀器性能丈量范圍：0

17、.1 - 200 mg N 檢測(cè)時(shí)間： 30mg N 用時(shí)3.5 分鐘 /200mg N 用時(shí)6.5分鐘 回收率： 99.5%，1-200mg N 范圍 重現(xiàn)性： RSD 1% 滴定器精度： 2.4ul/步試劑泵體積：0-150ml，10ml步進(jìn)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)：?jiǎn)螜C(jī)40個(gè)批次800個(gè)數(shù)據(jù)，Compass軟件無(wú)限進(jìn)樣器：20位/60位二蛋白質(zhì)快速測(cè)定法雙縮脲法 紫外分光光度法 染料結(jié)合法 水楊酸比色法 1.雙縮脲法 1 1反響原理反響原理 1 1原理原理 當(dāng)脲被小心地加熱至當(dāng)脲被小心地加熱至150150160160時(shí)，可時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成二由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成二縮脲也叫

18、雙縮脲，反響如下：縮脲也叫雙縮脲，反響如下：150 160222223H NCONH +H-N(H)-CONHH NCONHCONH +NH C 雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反響稱(chēng)為雙縮脲反響：2 2方法特點(diǎn)及運(yùn)用范圍方法特點(diǎn)及運(yùn)用范圍 由于蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵-CO-NH-，與雙縮脲構(gòu)造類(lèi)似，故也能呈現(xiàn)此反響而生成紫紅色配合物，在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長(zhǎng)為560nm 本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。 本法亦適用于豆類(lèi)、油料、米谷等作物種子及肉類(lèi)等樣品測(cè)

19、定。3 3操作方法操作方法規(guī)范曲線的制造規(guī)范曲線的制造按蛋白質(zhì)含量按蛋白質(zhì)含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分別稱(chēng)取混合均勻的規(guī)范蛋白質(zhì)分別稱(chēng)取混合均勻的規(guī)范蛋白質(zhì)8 支支50mL 納氏比納氏比色管中色管中各參與各參與1mL 四氯化碳四氯化碳用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀釋至釋至50mL振搖振搖10min靜置靜置1h取上層清液離心取上層清液離心5min取離心分別后的透明液取離心分別后的透明液于比色皿中于比色皿中以蒸餾水作參比液調(diào)理儀器零點(diǎn)并測(cè)以蒸餾水作參比液調(diào)理儀器零點(diǎn)并測(cè)定各溶液的吸光度定各溶液的吸光度A560nm 波長(zhǎng)蛋白

20、質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度光度A 為縱坐標(biāo)繪制規(guī)范曲為縱坐標(biāo)繪制規(guī)范曲線。線。以采用凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣以采用凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品作為規(guī)范蛋白質(zhì)樣品作為規(guī)范蛋白質(zhì)樣樣品的測(cè)定樣品的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品適量即使得蛋白質(zhì)含量在40110mg 之間于50mL納氏比色管中，加1mL 四氯化碳，按上述步驟顯色后，在一樣條件下測(cè)其吸光度A。用測(cè)得的A 值在規(guī)范曲線上即可查得蛋白質(zhì)毫克數(shù)，進(jìn)而由此求得樣品中的蛋白質(zhì)含量。4 4結(jié)果計(jì)算結(jié)果計(jì)算100/100 )cmggm蛋白質(zhì)（式中 c由規(guī)范曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg； m樣質(zhì)量量，g。5 5闡明及本卷須知闡明及本卷須

21、知 蛋白質(zhì)的種類(lèi)不同，對(duì)發(fā)色程度影響不大。 規(guī)范曲線制造完好后，無(wú)需每次再作規(guī)范曲線。 含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去。 樣品中有不溶性成分存在時(shí)，會(huì)給比色測(cè)定帶來(lái)困難，此時(shí)可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進(jìn)展測(cè)定。 當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時(shí)，假設(shè)有多量糖類(lèi)共存，那么顯色不好，會(huì)使測(cè)定值偏低。 堿性硫酸銅溶液由0.1mol 氫氧化鉀、5g 酒石酸鉀鈉、1.6g 硫酸銅溶于水后加水至1000mL 配成。2.2.福林福林- -酚比色法酚比色法原理原理蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (或多肽或多肽) )分子中含有酪氨酸或色氨酸分子中含有酪氨酸或色氨酸, ,能與能與Folin-Folin-酚試劑起氧化復(fù)原反響酚試劑起氧化復(fù)原反響

22、, ,生成藍(lán)生成藍(lán)色化合物色化合物, ,藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比, ,可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度可用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度. . 是檢測(cè)可溶是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。 測(cè)定測(cè)定 汲取一定量的樣品稀釋液，參與試劑汲取一定量的樣品稀釋液，參與試劑甲，置于甲，置于2525中水浴保溫中水浴保溫10min10min，再參，再參與試劑乙，立刻混勻，保溫與試劑乙，立刻混勻，保溫30min30min，以，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定A750nm A750nm 值，與蛋值，與蛋白質(zhì)規(guī)范液作對(duì)照，求出樣品的蛋白白質(zhì)規(guī)范液作對(duì)

23、照，求出樣品的蛋白質(zhì)的含量。質(zhì)的含量。 本法在本法在0 060mg/L 60mg/L 蛋白質(zhì)范圍呈良好蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。線性關(guān)系。3.3.考馬斯亮藍(lán)染料比色法考馬斯亮藍(lán)染料比色法 原理原理 考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G G250 250 是一種蛋白質(zhì)染料，與是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)范德華引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)范德華引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在色，在620nm 620nm 處有最大吸收值，可用于蛋處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。此法簡(jiǎn)單而快速，適宜白質(zhì)的定量測(cè)定。此法簡(jiǎn)單而快速，適宜大量樣品的測(cè)定，靈敏度與福林酚法類(lèi)似，大量樣品的測(cè)定，靈敏度與福林酚法類(lèi)似，但不受酚類(lèi)、游離

24、氨基酸和小分子的影響。但不受酚類(lèi)、游離氨基酸和小分子的影響。 測(cè)定測(cè)定 汲取樣品稀釋液汲取樣品稀釋液2mL2mL，加染料試劑，加染料試劑2mL2mL，混，混勻，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定勻，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測(cè)定A620nmA620nm，與蛋，與蛋白質(zhì)規(guī)范溶液對(duì)照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。白質(zhì)規(guī)范溶液對(duì)照，求出樣品蛋白質(zhì)含量。 本法在本法在0 0100mg/L 100mg/L 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系。氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法：原理、試劑、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算、闡明電位滴定法：原理、試劑、儀器、測(cè)定方法、結(jié)果計(jì)算三氨基酸態(tài)氮的測(cè)定三氨基酸態(tài)氮的測(cè)定1.雙指示劑甲醛

25、滴定法雙指示劑甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)參與甲醛溶液時(shí)，中性的內(nèi)鹽。當(dāng)參與甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消逝。這基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消逝。這樣就可以用強(qiáng)堿規(guī)范溶液來(lái)滴定樣就可以用強(qiáng)堿規(guī)范溶液來(lái)滴定-COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量?；?，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。RCHH3N CCOR CCOHOHNH2+HCHORCCOOHHN CH2+NaOHRCH COONaNCH2 (2) 操作方法操作方法 移取含氨基酸約移取含氨

26、基酸約2030mg的樣品溶的樣品溶液液2份，分別置于份，分別置于250ml錐形瓶中，各加錐形瓶中，各加50ml 蒸餾水，其中蒸餾水，其中1份參與份參與3滴中性紅指示滴中性紅指示劑，用劑，用0.1mol/L氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至由氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至由紅變?yōu)榧t變?yōu)?琥珀琥珀 色為終點(diǎn)；另色為終點(diǎn)；另1份參與份參與3滴百里滴百里酚酞指示劑及中性甲醛酚酞指示劑及中性甲醛20ml，搖勻，靜置，搖勻，靜置1分鐘，用分鐘，用0.1ml/L氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至氫氧化鈉規(guī)范溶液滴定至淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所耗費(fèi)的堿液淡藍(lán)色為終點(diǎn)。分別紀(jì)錄兩次所耗費(fèi)的堿液ml數(shù)。數(shù)。式中 c 氫氧化鈉規(guī)范溶液的濃度，mol/L; V1用中性紅作指示劑滴定時(shí)耗費(fèi)氫氧化鈉規(guī)范溶液的體積，mL; V2用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)耗費(fèi)氫氧化鈉規(guī)范溶液的