常見(jiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)比較

1、常見(jiàn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)比較1、化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析 (chemiluminescence immunoassay，CLIA) ，英音： ,kemi,lju:mi'nes?ns,imju:n ?u?'sei是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。CLIA 是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的

2、檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)最新免疫測(cè)定技術(shù)。1.1、化學(xué)發(fā)光免疫分析原理化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分 , 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化 , 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體 , 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí) , 同時(shí)發(fā)射出光子 (hv) , 利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì) (在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體 ) 直接標(biāo)記在抗原 (化學(xué)發(fā)光免疫分析 ) 或抗體 (免疫化學(xué)發(fā)光分析 ) 上, 或酶作用于發(fā)光底物。1.2、化學(xué)發(fā)光免疫分析類型精選

3、文庫(kù)化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法;(2)酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號(hào)試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CL IA ) ,是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的發(fā)光標(biāo)記物，其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-H 2O2 ) 作用而發(fā)光 , 強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成 , 為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標(biāo)記物用于免疫分析 , 其化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、無(wú)須催化劑 ; 檢測(cè)小分子抗原采用競(jìng)爭(zhēng)法 , 大分子抗

4、原則采用夾心法 , 非特異性結(jié)合少 , 本底低 ; 與大分子的結(jié)合不會(huì)減小所產(chǎn)生的光量 , 從而增加靈敏度?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析從標(biāo)記免疫分析角度 , 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 (chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 應(yīng)屬酶免疫分析 , 只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑 , 操作步驟與酶免分析完全相同 : 以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體 ) 進(jìn)行免疫反應(yīng) , 免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物 , 在信號(hào)試劑作用下發(fā)光, 用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 和堿性磷酸酶(AL P) , 它們有各自的發(fā)光底

5、物。標(biāo)記的 CLEIA-2精選文庫(kù)常用的底物為魯米諾 (3-氨基鄰苯二甲酰肼 ,luminol) , 或其衍生物如異魯米諾 (4-氨基鄰苯二甲酰肼 ) , 是一類重要的發(fā)光試劑。其結(jié)構(gòu)如圖 4 所示。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行 , 在過(guò)氧化物酶及活性氧 過(guò)氧化陰離子 (O2-) , 單線態(tài)氧 (1O2) , 羥自由基 (OH·) , 過(guò)氧化氫 (H2O2) 存在下 ,生成激發(fā)態(tài)中間體 , 當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光 , 其波長(zhǎng)為 425nm。早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原 (或抗體 ) , 但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度受到影響。近來(lái)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體 , 進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)

6、光底物, 在過(guò)氧化物酶和起動(dòng)發(fā)光試劑(N aOH-H2O2) 作用下 , 魯米諾發(fā)光 , 發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。 Kodak AmerliteTM半自動(dòng)分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計(jì)的。增 強(qiáng) 發(fā) 光 酶 免 疫 分 析 (enhanced luminescence enzymeimmunoassay, ELEIA )在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑, 如對(duì) 2 碘苯酚等 , 以增強(qiáng)發(fā)光信號(hào), 并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定 , 便于重復(fù)測(cè)量 , 從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。在全自動(dòng)分析儀上 , 還可通過(guò)計(jì)算機(jī)嚴(yán)密控制 , 進(jìn)行自動(dòng)操作 , 如加試劑 , 混合 , 溫育 , 洗滌 , 加發(fā)

7、光試劑 , 發(fā)光計(jì)數(shù) , 數(shù)據(jù)處理, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 , 直至完成病人血清樣品的分析并打印出結(jié)果。 AmerliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強(qiáng)劑 , 其發(fā)光時(shí)間可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)20min, 試劑盒有甲狀腺功能檢測(cè)的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性-3精選文庫(kù)激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮 , 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。標(biāo)記的 CLEIA所用發(fā)光底物為環(huán)1, 2-二氧乙烷衍生物 ,用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的金剛烷基, 其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)

8、和酶作用的基團(tuán), 在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物AMPPD 3-2-spiroadamatane-4-methoxy-4-3-phosphoryloxy-phenyl-1,2-dioxetane) Dioxetane 中文名為 : 3-(2-螺旋金剛烷 )-4-甲氧基 -4-(3-磷氧酰 )-苯基 -1,2-二氧環(huán)乙烷。在堿性磷酸酶 (ALP) 作用下 , 磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基 , 得到一個(gè)中等穩(wěn)定的中間體 AMPD ( 半壽期為 2-30min) , 此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子 , 當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)

9、生470nm 的光 , 可持續(xù)幾十分鐘 (如圖 5)。AMPPD 為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物 , 可用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酯酶或酶和抗體、 核酸探針及其它配基的結(jié)合物。 可檢測(cè)到堿性磷酸酯酶的濃度為 10-15mol/L 。美國(guó) DPC 公司的 Immulite 全自動(dòng)酶放大發(fā)光免疫分析儀 , 以堿性磷酸酶為標(biāo)記物 , 以金剛烷作發(fā)光底物 , 測(cè)定靈敏度相當(dāng)于 10-21mol/mL 的酶 , 采用聚苯乙烯珠作載體 , 其檢測(cè)水平已能達(dá)到 10-12g/mL。AMPPD 是一種生物化學(xué)領(lǐng)域中最新的超靈敏的堿性磷酸酶底-4精選文庫(kù)物，其特點(diǎn)：反應(yīng)速度快，在很短時(shí)間內(nèi)提供正確可靠的結(jié)果。在它的分子結(jié)構(gòu)

10、中有兩個(gè)重要部分， 一個(gè)是聯(lián)接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節(jié)環(huán)，它可以斷裂并發(fā)射光子；另一個(gè)是磷酸根基團(tuán)，它維持著整個(gè)分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在通常情況下，這種化合物很穩(wěn)定。但是當(dāng)有堿性磷酸酶存在時(shí)， DioxetanePhosphate作為酶的底物會(huì)在酶的催化一脫去磷酸根基團(tuán)，形成一個(gè)不穩(wěn)定的中間體。 這個(gè)中間體隨即自行分解 （二氧四節(jié)環(huán)斷裂），同時(shí)發(fā)射光子。該試劑采用微粒子化學(xué)發(fā)光技術(shù)，采用最新磁性微粒， 用以包被抗體。用堿性磷酸酶（ALP ）標(biāo)記抗原（抗體） 。經(jīng)過(guò)普通抗原抗體反應(yīng)，堿性磷酸酶結(jié)合在微粒子上，堿性磷酸酶的結(jié)合量同病人血清中的待測(cè)物質(zhì)成比例。經(jīng)過(guò)洗滌（反應(yīng)管兩邊有磁場(chǎng)，磁性微粒包被的抗原抗

11、體結(jié)合物被吸附在管子兩邊，其余游離部分被抽吸掉），最后加入發(fā)光底物DioxetanePhosphate，5 分鐘后，儀器通過(guò)光電倍增管檢測(cè)反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度。AMPPD 是堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光底物，在適宜的緩沖液中，隨著酶的催化水解作用， AMPPD 分解成 AMP-D ，后者發(fā)出強(qiáng)度很高的光信號(hào)，其發(fā)光的速度取決于堿磷酶的濃度。 當(dāng)堿磷酶偶合到雜交的探針時(shí)，便可以通過(guò)此系統(tǒng)檢測(cè)到雜交分子的存在量。2 微粒體發(fā)光免疫分析微 粒 體 發(fā) 光 免 疫 分 析 (microparticle luminescence enzyme immunoassay,MLEIA ),該免疫分析技術(shù)有兩種方法：一種是小

12、分子抗-5精選文庫(kù)原物質(zhì)的測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)法。 另一種是大分子的抗原物質(zhì)測(cè)定采用雙抗體夾心法。該儀器所用固相磁粉顆粒極微小，其直徑僅 1.0m，這樣大大增加了包被表面積， 增加抗原或抗體的吸附量， 使反應(yīng)速度加快，也使清洗和分離更簡(jiǎn)便，從而減少污染，降低交叉污染概率。反應(yīng)中使用堿性磷酸酶（ ALP ）標(biāo)記抗原或抗體，作用于其底物二氧乙烷磷酸酯，由其在激發(fā)態(tài)與基態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化中發(fā)生發(fā)光反應(yīng)。2.1、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)其原理是：用過(guò)量包被磁顆粒的抗體， 與待測(cè)的抗原和定量的標(biāo)記吖啶酯抗原同時(shí)加入反應(yīng)杯溫育，其免疫反應(yīng)的結(jié)合形式有兩種，一是標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物；二是測(cè)定抗原與抗體的結(jié)合形式。如受檢標(biāo)本中含有

13、待測(cè)抗原， 則與標(biāo)記抗原以同樣的機(jī)會(huì)與磁顆粒包被的抗體結(jié)合， 競(jìng)爭(zhēng)性地占去了吖啶酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被的抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使吖啶酯標(biāo)記抗原與磁顆粒包被的抗體的結(jié)合量減少。由于磁顆粒包被的抗體是過(guò)量的，足以與待測(cè)抗原結(jié)合。2.2、雙抗體夾心法：其原理是：標(biāo)記抗體與被測(cè)抗原同時(shí)與包被抗體結(jié)合成一種反應(yīng)形式，即包被抗體 -測(cè)定抗原 -發(fā)光抗體的復(fù)合物。具體講是以順磁性微珠作為載體包被抗體， 利用磁性微珠能被磁場(chǎng)吸引， 在磁場(chǎng)的作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)的特性，迅速捕捉到被測(cè)抗原，當(dāng)加入標(biāo)本后，標(biāo)本中的抗原與磁性抗體形成復(fù)合物， 在磁力的作用下， 協(xié)助該復(fù)合物快速地與其他非特異性物質(zhì)分離，使抗原 -抗體結(jié)合反應(yīng)

14、的時(shí)間縮短，測(cè)定時(shí)間減少， 降低了交叉污染的幾率， 此時(shí)再加入堿性磷酸酶標(biāo)記-6精選文庫(kù)的第二抗體，形成磁珠包被抗體-抗原 -酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌去掉未結(jié)合的抗體后，加入ALP 的發(fā)光底物環(huán)1，2-二氧乙烷衍生物AMPPD 。AMPPD 被復(fù)合物上 ALP 催化，迅速地去磷酸基團(tuán)， 生成不穩(wěn)定的中間體 AMPD 。AMPD 的快速分解，從高能激發(fā)態(tài)回到低能量的穩(wěn)定態(tài)時(shí)，持續(xù)穩(wěn)定地發(fā)射出光子（ hv），發(fā)射光所釋放的光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)記錄， 通過(guò)計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)將光能量強(qiáng)度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上轉(zhuǎn)換為待測(cè)抗原的濃度，并報(bào)告結(jié)果。其檢測(cè)水平可達(dá) pg/ml 水平，重復(fù)性好。3 、 電化學(xué)發(fā)光免疫分

15、析 (Electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA )ECLIA是繼放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定以后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，是電化學(xué)發(fā)光（ECL）和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物。它的標(biāo)記物的發(fā)光原理與一般的化學(xué)發(fā)光（CLA ）不同，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過(guò)程。 ECL 與 CLA 的差異在于 ECLA 是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)， 而 CLA 是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng)。 ECLA 不僅可以應(yīng)用于所有的免疫測(cè)定，而且還可用于 DNA RNA 探針檢測(cè)。其檢測(cè)原理（以 TSH 檢測(cè)為例）：第一步

16、：結(jié)合了活化的三聯(lián)吡啶釕衍生物即 Ru(bpy)32+ +N 羥基琥珀酰胺酯 （NHS）的 TSH 抗體和結(jié)合了生物素的TSH 抗體與待測(cè)血清同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育9-7精選文庫(kù)分鐘。第二步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應(yīng)杯中，再次孵育9分鐘，使生物素通過(guò)與親和素的結(jié)合將磁珠、TSH 抗體連接為一體，形成雙抗體夾心法。下一步，蠕動(dòng)泵將形成的Ru(bpy)3 2+ -抗體 -抗原 -抗體 -磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室， 此時(shí)，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時(shí)，游離的 TSH 抗體（與生物素結(jié)合的和與Ru(bpy)32+ 結(jié)合的抗體）也被吸出測(cè)量室。緊接著，蠕動(dòng)泵加入含三丙胺（TPA

17、）的緩沖液，同時(shí)電極加電壓，啟動(dòng) ECL 反應(yīng)過(guò)程。發(fā)光劑Ru(bpy) 32+和電子供體TPA 在陽(yáng)極表面可同時(shí)各失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)，使二價(jià)的 Ru(bpy) 3 2+被氧化成三價(jià)，后者是一種強(qiáng)氧化劑；另一方面，TPA 被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，后者很不穩(wěn)定，可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基 TPA，這是一種很強(qiáng)的還原劑， 可將一個(gè)電子給三價(jià)的Ru(bpy) 3 3+，使其形成激發(fā)態(tài)的 Ru(bpy)32+，而 TPA 自身被氧化成二丙胺和丙醛。 激發(fā)態(tài)的 Ru(bpy)32+通過(guò)熒光機(jī)制衰減， 發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng) 620nm 的光子，重新生成基態(tài)的Ru(bpy)32+。該過(guò)程

18、在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度，光強(qiáng)度與Ru(bpy)32+的濃度呈線性關(guān)系 ,故可測(cè)出待測(cè)抗原的含量。最后，終止電壓，移開(kāi)磁珠，加入清洗液沖洗流動(dòng)測(cè)量室，準(zhǔn)備下一個(gè)樣品測(cè)定。4、時(shí)間分辨熒光免疫分析(timeresolved fluoroimmunoassay，TRFIA )-8精選文庫(kù)TRFIA 以鑭系元素作為標(biāo)記物所建立的免疫測(cè)定技術(shù)。因鑭系元素(如 Eu3+)所發(fā)射的熒光壽命長(zhǎng)， 在測(cè)定特異性熒光時(shí)， 可通過(guò)延遲檢測(cè)時(shí)間而將標(biāo)本或環(huán)境中的非特異熒光扣除，使其具有良好信噪比。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 （TRFIA ）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗

19、原或抗體， 根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)， 用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。在生物流體和血清中的許多復(fù)合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光， 因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就會(huì)嚴(yán)重下降。 大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的， 因此將長(zhǎng)衰減壽命的標(biāo)記物與時(shí)間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合，就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到最小化。時(shí)間分辨熒光分析法（ TRFIA ）實(shí)際上是在熒光分析（ FIA ）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的， 它是一種特殊的熒光分析。 熒光分析利用了熒光的波長(zhǎng)與其激發(fā)波長(zhǎng)的巨大差異克服了普通紫外 -可見(jiàn)分光分析法中雜色光的影

20、響，同時(shí)，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上， 激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器， 從而大幅度地提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是，當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候，激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。 因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測(cè)量時(shí)沒(méi)有激發(fā)光的存在。 但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過(guò)-9精選文庫(kù)有非常少的稀土金屬 （Eu、Tb、Sm、Dy ）的熒光壽命較長(zhǎng)， 可達(dá) 12ms，能夠滿足測(cè)量要求，因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法，即使用長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物， 在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法醫(yī)學(xué)教|育網(wǎng)搜集整理。平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和 Tb（鋱），Eu 熒光壽命1ms，在水中不穩(wěn)定， 但加入增強(qiáng)劑后可以克服； Tb 熒光壽命 1.6ms，水中穩(wěn)定，但其熒光波長(zhǎng)短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解，因此從測(cè)量方法學(xué)上看Tb 很好，但不適合用于生物分析，故Eu 最為常用。4.1、時(shí)間分辨信號(hào)原理普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)