單克隆抗體制備最新版本

1、編輯ppt單克隆抗體制備單克隆抗體制備Monoclonal antibody 單個(gè)單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的針對(duì)同一個(gè)淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的針對(duì)同一個(gè) 抗抗原決定簇的抗體。分三個(gè)階段：原決定簇的抗體。分三個(gè)階段：（1）免疫）免疫Balb/c小鼠小鼠（2）建立篩選方法和程序）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤的生成）雜交瘤的生成編輯ppt一、動(dòng)物免疫一、動(dòng)物免疫1 Balb/c小鼠小鼠6-8周齡，周齡，25g左右，雌性較佳左右，雌性較佳2 免疫方法免疫方法（1）首次腹腔免疫）首次腹腔免疫0.5 ml抗原與福氏完全佐劑抗原與福氏完全佐劑 1：1的混和液，一般的混和液，一般2-3只鼠只鼠（2）30天后加強(qiáng)

2、免疫，用福氏不完全佐劑天后加強(qiáng)免疫，用福氏不完全佐劑編輯ppt（3）15天后，尾靜脈注射天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫水劑抗原，免疫 3天后，去脾臟融合天后，去脾臟融合 對(duì)于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數(shù)，具體對(duì)于抗原性弱的抗原，可增加免疫次數(shù)，具體 程序依抗原性質(zhì)而定。程序依抗原性質(zhì)而定。編輯ppt可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白）可溶性蛋白（提取或表達(dá)的蛋白） 50-100g顆粒性蛋白（病毒）顆粒性蛋白（病毒） 50-100g細(xì)菌細(xì)菌 106CFU活細(xì)胞活細(xì)胞 （哺乳動(dòng)物細(xì)胞）（哺乳動(dòng)物細(xì)胞） 105-7CFU活癌源細(xì)胞活癌源細(xì)胞 104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）糖類（多糖、糖蛋

3、白） 100-200g核酸核酸 100-200g編輯ppt1 在液氮罐中取保存的在液氮罐中取保存的SP2/0細(xì)胞，以細(xì)胞，以 MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇，培養(yǎng)基復(fù)蘇，37 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲107-108CFU的的 SP2/0細(xì)胞細(xì)胞3 500 g離心離心5min，棄上清，棄上清4 輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)細(xì)胞，重懸于輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)細(xì)胞，重懸于20 mL MEM營(yíng)養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)液中二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)二、骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)編輯ppt注意要點(diǎn)：注意要點(diǎn)：1 如細(xì)胞外觀不健康，或生長(zhǎng)密度不好，應(yīng)如細(xì)胞外觀不健康，或生長(zhǎng)密度不好，應(yīng)檢測(cè)是否檢測(cè)是否 有支原體污染有

4、支原體污染2 一次用一個(gè)凍存管里的細(xì)胞融合，應(yīng)避免一次用一個(gè)凍存管里的細(xì)胞融合，應(yīng)避免長(zhǎng)期培養(yǎng)長(zhǎng)期培養(yǎng)3 融合的細(xì)胞要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期融合的細(xì)胞要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期編輯ppt三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備三、飼養(yǎng)細(xì)胞的制備1 取清潔級(jí)取清潔級(jí)ICR小鼠小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置只，斷頸椎殺死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 將小鼠四肢固定，腹部朝上將小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜內(nèi)，無(wú)菌打開小鼠腹部皮膚在生物安全柜內(nèi)，無(wú)菌打開小鼠腹部皮膚4 用用20mL注射器吸取注射器吸取15mLMEM營(yíng)養(yǎng)液，注入營(yíng)養(yǎng)液，注入小鼠腹腔小鼠腹腔編輯ppt5 輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來(lái)回抽吸幾

5、輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器來(lái)回抽吸幾 次，次， 將小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞吸出，置細(xì)胞將小鼠腹腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞吸出，置細(xì)胞 瓶?jī)?nèi)待用瓶?jī)?nèi)待用6 將飼養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)至將飼養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)至50mL離心管內(nèi)，離心管內(nèi)，500g離心離心 5min，以，以HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)待用養(yǎng)瓶?jī)?nèi)待用編輯ppt注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙緡?yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙? 吸取腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不能將腸道刺破，否吸取腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不能將腸道刺破，否 則會(huì)造成污染則會(huì)造成污染3 如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應(yīng)調(diào)整針頭的如腹腔里的脂肪塊堵塞針頭，應(yīng)調(diào)整針頭的 位置，重新吸取細(xì)

6、胞液位置，重新吸取細(xì)胞液編輯ppt四、脾細(xì)胞的制備四、脾細(xì)胞的制備1 取取Balb/c小鼠小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置只，斷頸椎殺死小鼠，置 70%酒精溶液中浸泡酒精溶液中浸泡10min2 將小鼠四肢固定，腹部朝上將小鼠四肢固定，腹部朝上3 在生物安全柜內(nèi)，無(wú)菌打開小鼠腹腔在生物安全柜內(nèi)，無(wú)菌打開小鼠腹腔4 小心分離出脾臟，置含有小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營(yíng)養(yǎng)液的培營(yíng)養(yǎng)液的培 養(yǎng)皿內(nèi)養(yǎng)皿內(nèi)編輯ppt5 用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾 細(xì)胞分離出來(lái)細(xì)胞分離出來(lái)6 用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液吸置用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液吸置50mL

7、離離 心管中，沉降心管中，沉降5min7 將細(xì)胞懸液吸置另外一支離心管中，將細(xì)胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心離心 5min，棄上清，沉淀以，棄上清，沉淀以20mL MEM培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)基重懸編輯ppt注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 嚴(yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙緡?yán)禁用燃燒的棉球?qū)π∈笙? 取脾臟時(shí)，如果脾臟被脂肪粘連，需小心，取脾臟時(shí)，如果脾臟被脂肪粘連，需小心， 不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3 如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，如果脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好， 應(yīng)選用備用小鼠的脾臟應(yīng)選用備用小鼠的脾臟編輯ppt五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)五、細(xì)胞融合及

8、培養(yǎng)1 以以2：1混合脾臟細(xì)胞和混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，加至細(xì)細(xì)胞，加至細(xì) 胞融合管中胞融合管中2 在室溫下在室溫下500g離心離心10min，棄上清，棄上清3輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)和混合細(xì)胞，后置輕輕振動(dòng)離心管以松動(dòng)和混合細(xì)胞，后置 37水浴水浴4 在在60S內(nèi)用巴氏吸管將內(nèi)用巴氏吸管將0.8mL預(yù)熱至預(yù)熱至37 PEG1500緩慢加至細(xì)胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次緩慢加至細(xì)胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次編輯ppt5 在在90S內(nèi)，用移液管輕輕將內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至預(yù)熱至37的的MEM培養(yǎng)基加至融合管中培養(yǎng)基加至融合管中37水浴水浴5min室溫下室溫下500g離心離心10min，棄上清，棄上清

9、6 在融合管內(nèi)加入在融合管內(nèi)加入HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基20mL，將沉，將沉淀懸浮，后移置淀懸浮，后移置250mL的玻璃瓶中，并加的玻璃瓶中，并加入入HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基30mL，后加入，后加入10-15mL飼飼養(yǎng)細(xì)胞懸液養(yǎng)細(xì)胞懸液編輯ppt9 將細(xì)胞懸液加至將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2- 3滴，約滴，約0.1-0.15mL10 將細(xì)胞培養(yǎng)板置將細(xì)胞培養(yǎng)板置37 飽和濕度的飽和濕度的CO2 培養(yǎng)培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 培養(yǎng)培養(yǎng)3天后可取出細(xì)胞板在倒置顯微鏡下觀天后可取出細(xì)胞板在倒置顯微鏡下觀 察細(xì)胞融合情況察細(xì)胞融合情況編輯ppt12 培養(yǎng)置第培養(yǎng)置第5天時(shí)用天時(shí)用

10、HAT培養(yǎng)基換液，換培養(yǎng)基換液，換1/213 7-8天用天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液培養(yǎng)基換液，全部換液14 10-14天后，雜交瘤細(xì)胞占孔底天后，雜交瘤細(xì)胞占孔底1/3以上，以上， 細(xì)胞上清變黃，可以檢測(cè)融合細(xì)胞上清里細(xì)胞上清變黃，可以檢測(cè)融合細(xì)胞上清里 的抗體。的抗體。編輯ppt注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 脾臟細(xì)胞與脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的比例在細(xì)胞的比例在2：1 5：1最好最好2 細(xì)胞融合是關(guān)鍵步驟，避免用力吸打細(xì)胞融合是關(guān)鍵步驟，避免用力吸打3 細(xì)胞融合后細(xì)胞融合后3天要注意檢查是否污染，包括天要注意檢查是否污染，包括 細(xì)菌和真菌，一發(fā)現(xiàn)污染，要盡快棄去細(xì)菌和真菌，一發(fā)現(xiàn)污染，要盡快棄去

11、4 換液時(shí)不要影響孔底的雜交瘤細(xì)胞，不要吸換液時(shí)不要影響孔底的雜交瘤細(xì)胞，不要吸出或沖散出或沖散編輯ppt六、雜交瘤細(xì)胞的篩選六、雜交瘤細(xì)胞的篩選 大約有大約有10%的雜交瘤細(xì)胞能分泌抗體，而的雜交瘤細(xì)胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞更少，故需要篩分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細(xì)胞有多種方法，如選。篩選抗體分泌細(xì)胞有多種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接等。其中間接ELISA應(yīng)用最廣。應(yīng)用最廣。編輯ppt注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 因單抗是鼠源的，故酶標(biāo)記抗抗體常用酶標(biāo)因單抗是鼠源的，故酶標(biāo)記抗抗體常用酶標(biāo)羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包括抗羊抗鼠或兔抗鼠

12、抗體，包括抗IgG、IgM的抗的抗體。如體。如 單用酶標(biāo)記抗單用酶標(biāo)記抗IgG抗體，則抗體，則IgM類單抗類單抗就不能被篩選出來(lái)。就不能被篩選出來(lái)。2 陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞長(zhǎng)孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，上清再檢測(cè)一次滿后，上清再檢測(cè)一次3 篩選方法應(yīng)在細(xì)胞融合前建立好，一部篩選篩選方法應(yīng)在細(xì)胞融合前建立好，一部篩選特異單抗的方法最好特異單抗的方法最好編輯ppt七、雜交瘤細(xì)胞克隆七、雜交瘤細(xì)胞克隆 在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞中，可能混在分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞中，可能混有不分泌單抗的細(xì)胞克??；另外分泌單抗的克隆有不分泌單抗的細(xì)胞克隆；另外分泌單抗的克隆在初代不

13、穩(wěn)定，有一部分細(xì)胞染色體常丟失，為在初代不穩(wěn)定，有一部分細(xì)胞染色體常丟失，為了防止不分泌抗體的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，在早期應(yīng)對(duì)了防止不分泌抗體的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，在早期應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆。常用有限稀釋法，一般來(lái)說(shuō)，雜細(xì)胞進(jìn)行克隆。常用有限稀釋法，一般來(lái)說(shuō)，雜交瘤經(jīng)過(guò)交瘤經(jīng)過(guò)3-4次克隆后就穩(wěn)定了。次克隆后就穩(wěn)定了。編輯ppt1 在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有在克隆的前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL飼飼養(yǎng)細(xì)胞的養(yǎng)細(xì)胞的96孔板孔板2 將將24孔板里的待克隆細(xì)胞懸浮，取孔板里的待克隆細(xì)胞懸浮，取0.1mL細(xì)胞懸液加入細(xì)胞懸液加入0.9mL臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻臺(tái)盼藍(lán)染色液，混勻3 血液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)血液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4 在在2

14、4孔培養(yǎng)板上，對(duì)待克隆細(xì)胞懸液進(jìn)行孔培養(yǎng)板上，對(duì)待克隆細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍比稀釋倍比稀釋編輯ppt5 當(dāng)稀釋至當(dāng)稀釋至100CFU/mL時(shí)，取時(shí)，取1mL細(xì)胞懸液至細(xì)胞懸液至裝有裝有10mLHT培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至培養(yǎng)基的瓶中，再分別加至96孔板孔板中（預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞），中（預(yù)先加有飼養(yǎng)細(xì)胞），0.1mL/孔孔6將細(xì)胞培養(yǎng)板置將細(xì)胞培養(yǎng)板置37 飽和濕度的飽和濕度的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)10天左右，注意觀察天左右，注意觀察7 大約大約3-4天在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞克隆，天在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞克隆，5-7天換液一次，天換液一次，8 10天左右克隆長(zhǎng)滿，可以檢測(cè)上清天左右克隆長(zhǎng)滿，

15、可以檢測(cè)上清編輯ppt注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：1 上清液要在上清液要在24 h內(nèi)測(cè)定內(nèi)測(cè)定2 細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)只計(jì)活細(xì)胞（淡藍(lán)色），死細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)只計(jì)活細(xì)胞（淡藍(lán)色），死細(xì)胞為深藍(lán)色，且沒有光澤為深藍(lán)色，且沒有光澤3 如有高質(zhì)量的如有高質(zhì)量的FCS，可不用飼養(yǎng)細(xì)胞，可不用飼養(yǎng)細(xì)胞4 一個(gè)克隆需亞克隆一個(gè)克隆需亞克隆3-4次，才穩(wěn)定次，才穩(wěn)定5 如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加1mol/mL的的Cu SO4溶液溶液編輯ppt七、實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？贵w制備七、實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？贵w制備體外上清液培養(yǎng)體外上清液培養(yǎng)1 雜交瘤細(xì)胞先在雜交瘤細(xì)胞先在25mL 的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中

16、培養(yǎng)2 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后轉(zhuǎn)至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后轉(zhuǎn)至50或或100mL的細(xì)胞培的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3 當(dāng)細(xì)胞液變黃后，收集上清液，再加新鮮的當(dāng)細(xì)胞液變黃后，收集上清液，再加新鮮的培養(yǎng)液，并重復(fù)收集上清培養(yǎng)液，并重復(fù)收集上清2次次4讓細(xì)胞長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，直至死亡，并收集上讓細(xì)胞長(zhǎng)至飽和狀態(tài)，直至死亡，并收集上清清編輯ppt體內(nèi)生產(chǎn)腹水體內(nèi)生產(chǎn)腹水1 正常培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞正常培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞2 飼養(yǎng)飼養(yǎng)Balb/c小鼠，注射細(xì)胞一周前通過(guò)腹腔小鼠，注射細(xì)胞一周前通過(guò)腹腔注射注射0.5mL降植烷降植烷3 在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)量以培養(yǎng)液調(diào)整至（將細(xì)胞數(shù)量以培養(yǎng)液調(diào)整至（2-10）107CFU4 小鼠腹腔注射小鼠腹腔注射0.5mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液，1-2周后發(fā)周后發(fā)展成癌性腹水展成癌性腹水編輯ppt5 用注射器收集腹水，用注射器收集腹水，3-4天收集一次，每只鼠天收集一次，每只鼠 可收集可收集2-3次次6 腹水腹水5000g離心離心10min，收集澄清的上清，收集澄清的上清， 除去油脂除去油脂7 加入加入0.05%的疊氮鈉，小量分裝保存。長(zhǎng)期的疊氮鈉，小量分裝保存。長(zhǎng)期