外科學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文RNA干擾技術(shù)特異性抑制腎癌survivin表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究

1、外科學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 RNA干擾技術(shù)特異性抑制腎癌survivin表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究關(guān)鍵詞：腎癌 RNA干擾 survivin基因 基因表達(dá) 基因治療摘要：RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放

2、療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了S

3、urvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-

4、1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗

5、性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示78

6、6-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivi

7、n的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基

8、因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。正文內(nèi)容 RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的

9、基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感

10、，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因

11、在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivi

12、n mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)

13、曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCAC

14、TGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為

15、0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下

16、一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、

17、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

18、入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特

19、點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH

20、5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Surv

21、ivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配

22、外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基

23、因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RN

24、Ai）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或

25、喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的S

26、urvivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MT

27、T法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及

28、轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358

29、：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯

30、增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。

31、我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中

32、無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建

33、的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survi

34、vin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)

35、錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)

36、報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM00116

37、8）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在

38、mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策

39、略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀

40、后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

41、 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法

42、： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以

43、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；surviv

44、in2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤

45、以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的

46、基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成

47、員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上

48、，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Survivin為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Sur

49、vivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中

50、序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-survivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌7

51、86-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGACCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012

52、270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.RT-PCR顯示S1組和S3組中SUrvivin mRNA的表達(dá)下調(diào)；3.Western-blot顯示S1組和S3組中Survivin蛋白的表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論： 第

53、一部分：在腎癌786-O細(xì)胞中Survivin基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達(dá)，提示Survivin基因與腎癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為Survivin為靶點(diǎn)的人腎癌基因治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。第二部分：RNA干擾主要利用雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)Dicer酶的識(shí)別、結(jié)合、酶切產(chǎn)生有活性的長(zhǎng)度為21-23nt小干擾RNA，與目的基因mRNA結(jié)合并使之降解，從而抑制目的基因的表達(dá)。我們?cè)隗w外合成的針對(duì)Survivin的siRNA為下一步干擾786-O細(xì)胞中Survivin的表達(dá)提供了有力的武器。第三部分：體外轉(zhuǎn)錄合成特異性survivin siRNA能有效抑制腎癌786-O細(xì)胞株中survivin的

54、表達(dá)，抑制細(xì)胞的活性，為腎癌的基因治療提供了一種新策略。RNA干擾（RNA interfering，RNAi）是近年發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默技術(shù)，已成為對(duì)目的基因的功能、抗病毒和抗腫瘤基因治療方面研究的熱點(diǎn)；與其他腫瘤基因治療技術(shù)一樣，RNAi在應(yīng)用過(guò)程中同樣存在靶向性的問(wèn)題。凋亡抑制基因Survivin是IAP家族的一個(gè)新成員，廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織，而在正常組織及癌旁組織中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。Survivin除具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的功能外，還參與腫瘤血管生成、引起腫瘤細(xì)胞對(duì)放療及化療的耐藥性等。發(fā)現(xiàn)至今，Survivin已成為腫瘤基因治療理想的靶點(diǎn)和熱點(diǎn)。 腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性

55、腫瘤之一，發(fā)病率及惡性程度高。其早期無(wú)癥狀，出現(xiàn)癥狀后約30患者已到晚期，就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果差或喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)；對(duì)放射治療、化學(xué)治療和激素治療不敏感，其5年生存率不足10，所以迫切需要尋求新的治療手段提高療效。近年來(lái)有研究表明Survivin在腎癌中高表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)人腎癌786-O高表達(dá)Survivin的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)，使用載體pGenesil-1構(gòu)建的重組質(zhì)粒shRNA-Survivin，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Survivin的人腎癌786-0細(xì)胞株，顯著抑制了SurvivinSurvivin mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，并抑制了細(xì)胞的活性，從體外細(xì)胞水平為以Surviv

56、in為靶基因的RNAi治療腎癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 目的： 第一部分：檢測(cè)人腎癌786-O細(xì)胞株中的Survivin基因表達(dá)水平，探討Survivin基因在人腎癌786-O細(xì)胞株中表達(dá)的意義。第二部分：設(shè)計(jì)針對(duì)survivin基因的siRNA并與質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選抗性菌落擴(kuò)增培養(yǎng)重組質(zhì)粒。第三部分：根據(jù)Survivin基因高表達(dá)于腎癌以及shRNA-Survivin抑制786-O細(xì)胞內(nèi)Survlvm基因表達(dá)的特點(diǎn)，將shRNA-Survivin及對(duì)照質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染至786-O后，了解RNA干擾Survivin基因后對(duì)786-O活性的影響，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后786-O細(xì)胞

57、中的Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平。 方法： 第一部分：1.培養(yǎng)人腎癌786-O細(xì)胞株并用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線；2.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在786-O細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平；3.Western-blot檢測(cè)Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。第二部分：1.根據(jù)survlvin基因在GeneBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的三組陽(yáng)性siRNA和一組陰性對(duì)照，其轉(zhuǎn)錄模板與pGenesil-1連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5菌株；2.挑選卡那霉素抗性菌落并擴(kuò)增培養(yǎng)；3.提取各組卡那抗性菌落的質(zhì)粒。第三部分：1.重組質(zhì)粒pGenesil-1-survivinl、pGenesil-1-surv

58、ivin2、pGenesil-3、陰性對(duì)照質(zhì)粒HK以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至786-O；2.觀察轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染率，采用MTT法繪制轉(zhuǎn)染后各組及脂質(zhì)體組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3.RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA在各組的轉(zhuǎn)錄水平；4.Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白在各組的表達(dá)水平。 結(jié)果： 第一部分：1.腎癌786-O細(xì)胞株經(jīng)培養(yǎng)其倍增時(shí)間為52.22h，與文獻(xiàn)報(bào)道相符；2.RT-PCR顯示786-O中有Survivin mRNA的表達(dá)；3.Western-blot顯示786-O中有Survivin基因蛋白質(zhì)的表達(dá)。第二部分：成功得到三組陽(yáng)性siRNA（survivin1 GGA

59、CCACCGCATCTCTACA166；survivin2 GCATTCGTCCGGTTGCGCT358：survivin3GGCTGGCTTCATCCACTGC241）和一組陰性對(duì)照（GACTTCATAAGGCGCATGC）。Survivin基因有三個(gè)亞型，其中除了survivin2不能與variant2（NM001012270）匹配，只能與variant1（NM001168）、variant3（NM001012271）匹配外，survivin1和survivin3均可與survivin的3個(gè)亞型匹配。第三部分：1.轉(zhuǎn)染24h后，各組細(xì)胞形態(tài)相似，熒光顯微鏡下ABCD組可見(jiàn)少量綠色熒光。54h，各組部分細(xì)胞變圓，折光性降低，有較多壞死細(xì)胞，尤以A、C嚴(yán)重，熒光下A、B、C、D組綠色熒光較前明顯增多。轉(zhuǎn)染率的計(jì)算，轉(zhuǎn)染各組約為35，單純脂質(zhì)體組為0；2.R