導向性IFNα2aαMSH基因的克隆、表達、純化及鑒定

1、導向性IFN2aMSH基因的克隆、表達、純化及鑒定【關鍵詞】 干擾素2a；促黑素；大腸桿菌；基因表達；pET22b(+)載體IFN2a是一種具有抗腫瘤活性的細胞因子，已被FDA批準用于多種惡性腫瘤的治療，但因其在臨床治療中需大劑量長期給藥且常會引發(fā)明顯的毒副作用，使其應用受到一定的限制. MSH是一種由多種細胞分泌的含13肽的激素，也是一種天然存在的多肽，目前的研究證實其可通過免疫調節(jié)作用抑制惡性黑色素瘤細胞的黏附、侵襲和轉移1-2. Froidevanx等3研究表明所有黑素細胞和黑素瘤細胞都表達MSH受體MC1R，且黑素瘤細胞表達MC1R上調，人黑素瘤細胞表面MC1R密度為9005700結合

2、位點/細胞，而正常狀態(tài)下人表皮黑素細胞上MC1R不超過100個結合位點/細胞. 我們利用基因重組技術，構建導向性IFN2aMSH融合基因表達載體，并誘導其在大腸桿菌中表達，旨在為惡性黑色素瘤的靶向性治療提供基礎資料.1材料和方法1.1材料1 / 14質粒pET22b(+)、菌種DH5及RosettagamiTM2(DE3)，藥學系生物技術中心保存；各種限制性內切酶，T4 DNA 連接酶以及DNA Marker DL2000（TaKaRa公司）；片段合成與序列測定由上海英駿生物技術有限公司完成；DNA凝膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒（Omega公司）；低Mr蛋白標準（MBI公司）；鼠抗人干擾素（S

3、anta Cruz公司）；羊抗鼠IgGAp（華美工程公司）：顯色劑（美國Promega公司）；蛋白胨、酵母粉、低熔點瓊脂糖（Spanish公司）；異丙基硫代D半乳糖苷（IPTG，華美生物工程公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1IFN2aMSH融合基因的克隆按照大腸桿菌慣用密碼子設計并合成了編碼MSH導向肽的核苷酸片段：片段1（48 nt）：5 GAT CCTCCT ACT CCA TGG AAC ACT TCC GTT GGG GTA AAC CGG TTT AGG3；片段2（48 nt）：5 TCG ACC TAA ACC GGT TTA CCC CAA CGG AAG TG

4、T TCC ATG GAG TAG GAG3. 這兩個片段退火后可形成MSH導向肽的核苷酸片段以及5端和3端的粘性末端（BamH I和SalI的酶切位點）； 將合成的兩個片段煮沸變性10 min后退火，再與用BamHI和SalI雙酶切處理過的pET22b（+）IFN2aNGR質粒連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5，培養(yǎng)篩選陽性克隆(圖1).1.2.2重組質粒的酶切和測序從抗生素瓊脂培養(yǎng)平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質粒DNA，用限制性內切酶Nde和Nco進行雙酶切鑒定及核酸序列分析. 將測序正確者命名為pET22b（+）IFN2aMSH.1.2.3重組蛋白的誘導表達重組

5、質粒pET22b(+)IFN2aMSH轉化感受態(tài)細胞RosettagamiTM2(DE3)，挑取mAb接種于含氨芐青霉素（50 mg/L）、四環(huán)素（25 mg/L）、鏈霉素（10 mg/L）及氯霉素（35 mg/L）的LB培養(yǎng)基中，次日清晨按1100的比例接種于上述同樣條件的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至A600 nm=0.40.6時加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導表達，37振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，行SDSPAGE鑒定.1.2.4IFN2aMSH的初步純化和Western Blot鑒定1.2.4.1超聲裂菌重組蛋白IFN2aMSH是以包涵體的形式存在，取5 g表達濕菌，將其懸浮于35

6、 mL STE(100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris.Cl, PH 8.0, 1 mmol/L EDTA)中，在冰浴中300 W超聲裂菌，超聲5 s，間歇10 s，全程20 min，4, 10 000 g離心20 min，保留上清，行SDSPAGE鑒定，并與溶菌酶裂菌結果進行比較.1.2.4.2疏水作用層析初步純化重組蛋白層析柱為Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)；緩沖液A：25 mmol/L Tris.Hcl, 1 mmol/LEDTA, 1 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.5；緩沖液B: 25 mmol/L T

7、ris.Hcl,1 mmol/L EDTA, pH 7.5；將超聲裂菌上清在冰浴中進行硫酸銨沉淀，硫酸銨的終濃度為400 g/L, 4, 10 000 g離心20 min，保留沉淀，用約20倍體積的A液溶解沉淀，4，10 000 g離心20 min，保留上清備用. 層析柱以緩沖液A平衡至基線穩(wěn)定，上樣后繼續(xù)以緩沖液A沖洗至基線穩(wěn)定，線性梯度洗脫100% A至100% B,洗脫體積為約25個柱床體積，流速為3 mL/min.1.2.4.3Western Blot于SDSPAGE結束后拆下凝膠，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用鼠抗人IFN mAb（1100），行Western Blot鑒定.1.2.

8、4.4蛋白質含量及活性測定將WISH細胞在含抗生素、谷氨酰胺和100 g/L FCS（pH 7.4）的Eagles培養(yǎng)液中37培養(yǎng)過夜. 待細胞呈單層生長后棄培養(yǎng)液，并用胰酶消化細胞. 將消化的WISH細胞按1000個細胞/孔接種于96孔板. 37孵箱培養(yǎng)過夜. 換為含50 g/L FCS的Eagles液稀釋的不同濃度的待測樣品，繼續(xù)培養(yǎng)，次日換用含50 g/L FCS的Eagles培養(yǎng)液按11030稀釋的VSV病毒培養(yǎng)液，37培養(yǎng)24 h，觀察結果，以50%細胞保護的待測樣品稀釋度為其效價.2結果2.1IFN2aMSH的酶切鑒定用限制性內切酶Nde和Nco對重組質粒pET22b(+)IFN2

9、aMSH進行雙酶切，可見一約530 bp片段，與預期大小一致，證明目的片段已插入pET22b(+)載體中（圖2）. 測序結果與合成的MSH基因序列比對完全一致.2.2IFN2aMSH在大腸桿菌中的誘導表達SDSPAGE電泳結果表明，含有pET22b(+)IFN2aMSH的工程菌RosettagamiTM2(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導后在約20 ku處產(chǎn)生了一條新生蛋白條帶，與預期結果相符合；而未誘導的則無相應蛋白條帶出現(xiàn)（圖3）.2.3超聲裂菌及溶菌酶裂菌經(jīng)溶菌酶裂菌證實重組蛋白IFN2aMSH是以包涵體的形式存在，采用超聲裂菌的方法裂解菌體細胞，發(fā)現(xiàn)在裂菌上清中出現(xiàn)IFN2aM

10、SH目的蛋白條帶（圖4）.2.4IFN2aMSH的純化和Western Blot鑒定采用疏水作用層析進行重組蛋白的初步純化，可得到較高純度的IFN2aMSH（圖5），純化產(chǎn)物的Westernblot鑒定(圖6).2.5IFN2aMSH重組蛋白含量及活性的檢測溶菌酶裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分別為6.4×108 U/L, 4.176 g/L和1.536×108 U/g. 超聲裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分別為4×1011 U/L, 5.944 g/L和6.729×1010 U/g.3討論目前絕大多數(shù)的臨床藥物都存在一個不容忽視的缺陷，即缺

11、乏對病理部位的特異親和力. 大劑量給藥不僅使得藥物成本提高，還不可避免地產(chǎn)生非特異性毒性，對正常組織造成嚴重損傷，引發(fā)毒副作用. 為了克服這一難題，人們提出了導向性的治療策略，我們實驗室曾先后進行了NGR導向性腫瘤治療藥物的研發(fā)，如IFN2aNGR，tum5 NGR4-5.IFN是第一個應用于臨床的基因工程產(chǎn)品，但在實體瘤的治療中，注射入體內的IFN很少能達到腫瘤部位，因而治療效果較差1-2，MSH可與黑素瘤細胞表面的MC1R特異性結合，促進惡性黑色素瘤細胞的凋亡，并且通過皮膚基底膜的重建而抑制皮膚黑素瘤的轉移. Murata等6證實MSH在體內外均可通過皮膚基底膜的重建抑制鼠B16細胞的侵襲

12、. 李蠡等7研究發(fā)現(xiàn)MSH可明顯上調惡性黑色素瘤細胞Fas/FasL的表達，促進惡性黑色素瘤細胞的凋亡.為了提高IFN2a對腫瘤組織的選擇性，我們通過基因工程技術構建了融合表達載體pET22b(+)IFN2aMSH，并成功地在大腸桿菌中表達了融合蛋白IFN2aMSH，預期此種融合蛋白既具有與黑色素瘤特異性結合的能力，又具有IFN2a抗腫瘤活性，能提高治療作用，減低毒副反應.對于以包涵體形式存在的融合蛋白，由于包涵體結構的特殊性，在用表面活性劑和變性劑處理、溶解包涵體時，會引起重組蛋白的變性. 我們通過簡單的超聲裂菌使重組蛋白以可溶解的形式存在，避免了包涵體洗滌以及蛋白復性的過程，大大縮減了實驗

13、的進程，同時采用硫酸銨沉淀的方法，通過疏水作用層析一步分離得到較高純度的目的蛋白，可為今后對于以包涵體形式存在的融合蛋白的純化提供一個新的方法.【參考文獻】 1Zhu N, Lalla R, Eves P, et al. Melanoma cell migration is up regulated by tumour necrosis factoralpha and suppressed by alphamelanocytestimulating hormoneJ. Br J Cancer, 2004,90(7):1457-1463.2Eves P, Haycock J, Layton C,

14、 et al. Antiinflammatory and antiinvasive effects of alphamelanocytestimulating hormone in human melanoma cellJ.Br J Cancer, 2003,89(10):2004-2014. 3Froidevanx S, CalameChriste M, Tanner H, et al. A novel DOTAalphamelanocytestimulating hormone analog for metastatic melanoma diagnosisJ. J Nucl Med, 2002,43(12):1699-1706.4劉磊，孟潔如，趙寧，等. 融合蛋白IFN2aNGR在荷瘤小鼠體內的腫瘤局部分布和組織定位J. 第四軍醫(yī)大學學報，2004,25（15）:1400-1402.5Jieru M, Nan M, Zhen Y, et al. NGR enhanced the antiangiogenic activity of tum5J. J Biochem, 2006,140(2):1-6.6Murata J, Ayukawa K, Ogasawara M, et al. Alphamela