高表達(dá)JNK3促進(jìn)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

1、高表達(dá)JNK3促進(jìn)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡【摘要】 目的： 構(gòu)建人cJun氨基末端激酶3（JNK3）真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系；以表阿霉素作為凋亡誘導(dǎo)劑研究JNK3與細(xì)胞凋亡關(guān)系. 方法： 以pDBLeuJNK3質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增人JNK3基因全長(zhǎng)，DNA重組技術(shù)將其定向插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1/mycHis B，經(jīng)PCR和酶切鑒定，DNA測(cè)序正確，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)G418選擇培養(yǎng)，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系. RTPCR，Western Blot檢測(cè)攜帶Myc標(biāo)簽的JNK3融合蛋白的表達(dá)，流式檢測(cè)表阿霉素對(duì)穩(wěn)定表達(dá)JNK3基因的HEK293

2、細(xì)胞的促凋亡作用. 結(jié)果： 成功構(gòu)建了pcDNA3.1JNK3真核表達(dá)載體并已穩(wěn)定轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，成功地表達(dá)目的基因；與對(duì)照細(xì)胞相比表阿霉素能明顯促進(jìn)高表達(dá)JNK3基因的HEK293細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡. 結(jié)論： JNK3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立和高表達(dá)JNK3促進(jìn)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究JNK3的功能提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 CJum氨基末端激酶 真核表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染 因表 細(xì)胞凋亡0引言1 / 18cJun氨基末端激酶(cJun Nterminal kinases，JNKs)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein k

3、inase，MAPK)超家族之一. 在脊椎動(dòng)物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三種基因編碼，表達(dá)的JNK1，JNK2，JNK3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶. JNK3與JNK1，JNK2的不同在于：JNK3有一個(gè)與位于JNK1，JNK2的N末端保守的甲硫氨酸殘基融合在一起的延長(zhǎng)的N末端區(qū)域1；JNK1，JNK2在組織內(nèi)廣泛表達(dá)，JNK3在腦、心臟、睪丸等組織特異表達(dá). 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)JNK3參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，可促進(jìn)缺血、缺氧和有毒化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡. 目前對(duì)JNK3促細(xì)胞凋亡機(jī)制還不是很清楚. 我們通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JNK3基因的細(xì)胞系，以表阿霉素作為凋亡誘

4、導(dǎo)劑研究JNK3與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為研究JNK3促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制提供細(xì)胞模型.1材料和方法1.1材料菌株E.coli JM109，質(zhì)粒pDBLeuJNK3，pcDNA3.1/mycHis B和HEK293細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存. DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（Life Technologies公司）；PCR及酶切產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；DNA Marker，DNA限制性?xún)?nèi)切酶(EcoR，Xho)、pyrobest DNA polymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4 DNA連接酶（New England Biol

5、ab公司）；Trizol、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；AnnexinFITC 試劑盒（晶美生物工程有限公司）；Myc抗體、actin抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和ECL檢測(cè)試劑（Santa Cruz公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank登錄的人JNK3基因的序列(序列號(hào)為NM_002753)設(shè)計(jì)引物, 上游引物為：5ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT3，下游引物為：5ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG3，分別在上游引物和下游引物的5端加入EcoRV，X

6、hoI的酶切位點(diǎn)和3個(gè)保護(hù)堿基，引物由賽百盛公司合成.1.2.2人JNK3基因全長(zhǎng)的獲取以pDBLeuJNK3質(zhì)粒為模板，采用PCR擴(kuò)增人JNK3基因，全長(zhǎng)1269 bp. PCR 50 L反應(yīng)體系中加pDBLeuJNK3質(zhì)粒模板1 L，10×PCR Buffer 5 L，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 L, 10 mol/L JNK3上下游引物各2 L，pyrobest DNA polymerase 0.25 L，加無(wú)菌水至50 L. 反應(yīng)條件：94 5 min；94 30 s，62 30 s，72 80 s，35個(gè)循環(huán)；72 10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊

7、脂糖凝膠電泳分離鑒定并膠回收純化.1.2.3人JNK3真核表達(dá)載體的構(gòu)建將上述PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1/mycHis B質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoR和Xho酶切后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)，鋪在含氨芐青霉素的LB平板上篩選，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序分析后證實(shí)并命名為pcDNA3.1JNK3.1.2.4建立穩(wěn)定表達(dá)人JNK3的HEK293細(xì)胞系HEK293細(xì)胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37，50 mL/L CO2 的飽和濕度下培養(yǎng). 待細(xì)胞融合至7080時(shí)按照

8、Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組質(zhì)粒pcDNA3.1JNK3和空質(zhì)粒pcDNA3.1/mycHis B的轉(zhuǎn)染. 轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新鋪在直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，換含有G418(1400 mg/L)的選擇性培養(yǎng)基加壓培養(yǎng)2 wk，每3 d換液清除死亡細(xì)胞，待細(xì)胞培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的單克隆時(shí)挑選單克隆并依次轉(zhuǎn)移至96孔板、24孔板、6孔板、培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)擴(kuò)大培養(yǎng). 篩選出的穩(wěn)定表達(dá)人JNK3和Myc標(biāo)簽的HEK293細(xì)胞系，分別命名為HEK293JNK3細(xì)胞和HEK293mock細(xì)胞.1.2.5RTPCR檢測(cè)JNK3的表達(dá)收集HEK293

9、JNK3細(xì)胞和HEK293mock細(xì)胞，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄. 取1 g定量后的RNA，加水補(bǔ)至10 L，70 10 min，加10×反應(yīng)緩沖液2 L，MgCl2 4 L，dNTP 2 L，OligodT 1 L，rRNasin 0.5 L，AMV（15 U）0.75 L. 反應(yīng)體系共20 L；42 1 h；95 5 min；4 5 min. 以 GAPDH（900 bp）為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng). 在25 L PCR反應(yīng)體系中加入cDNA模板1 L，10×PCR Buffer 2.5 L，2.5 mmol/L dNTP 2

10、L，10 mol/L JNK3和GAPDH上下游引物各0.5 L，rTaq酶0.15 L，加水補(bǔ)足至25 L，反應(yīng)條件為：94 5 min；94 30 s，58 30 s, 72 80 s，30個(gè)循環(huán)；72 10 min. 取等體積RTPCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析.1.2.6Western Blot 檢測(cè)JNK3蛋白的表達(dá)收集篩選細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑的單去污細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4，12 000 g，離心10 min，收集上清. 對(duì)收集的蛋白樣品進(jìn)行定量，取20 g處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L 脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，與1200

11、0稀釋后的Myc一抗4 孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次. 然后與15000稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白，顯影.1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293JNK3細(xì)胞和HEK293mock細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為2×108/L，接種于50 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，同時(shí)加入終濃度為0.2，0.5，1.0 mg/L的表阿霉素，空白對(duì)照組加入等量DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行Annexin V/PI標(biāo)記：將細(xì)胞懸浮于250 L 結(jié)合緩沖液中，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1×109 /L, 加Annexin V/

12、FITC 5 L， 20 mg/L碘化丙錠溶液10 L，混勻，室溫避光孵育15 min，用適量稀釋緩沖液稀釋?zhuān)魇郊?xì)胞儀檢測(cè).2結(jié)果2.1人JNK3基因的擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，所得PCR片段約為1269 bp，與預(yù)期的人JNK3 cDNA全編碼區(qū)的長(zhǎng)度相符(圖1).2.2真核表達(dá)載體pcDNA3.1JNK3的構(gòu)建和鑒定篩選出的pcDNA3.1JNK3陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoR和Xho酶切后得到2個(gè)條帶(圖2)，1條為約1300 bp大小的目的條帶，1條為5500 bp大小的空載體條帶；以pcDNA3.1/mycHis B載體上的通用引物進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)pcDNA3.

13、1JNK3重組質(zhì)粒插人片段的序列與人JNK3的cDNA序列完全一致，表明人JNK3的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功. 1：DNA Marker(DL 2000)； 2：JNK3 PCR片段.圖1人JNK3基因的PCR擴(kuò)增（略）1：DNA marker(DL 15 000)； 2：pcDNA3.1/mycHis B； 3：pcDNA3.1JNK3.圖2pcDNA3.1JNK3重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（略）2.3JNK3穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選和鑒定提取G418篩選出的穩(wěn)定細(xì)胞株HEK293JNK3和HEK293mock細(xì)胞中的總RNA，RTPCR檢測(cè)JNK3的表達(dá). HEK293JNK3所提RNA能擴(kuò)增出代表JNK3

14、基因(1269 bp)及內(nèi)參GAPDH基因(900 bp)的條帶；而HEK293mock細(xì)胞所提RNA僅能擴(kuò)增代表內(nèi)參GAPDH基因的900 bp的條帶，說(shuō)明JNK3基因在穩(wěn)定細(xì)胞株中mRNA水平上得到了表達(dá)(圖3). 提取HEK293mock和HEK293JNK3細(xì)胞中的總蛋白，Western Blot檢測(cè)JNK3融合蛋白的表達(dá)，HEK293JNK3用Myc抗體檢測(cè)到約46 ku的JNK3融合蛋白條帶，而HEK293mock對(duì)照細(xì)胞則沒(méi)有相應(yīng)的條帶,表明JNK3基因在穩(wěn)定細(xì)胞株中蛋白水平上得到了表達(dá)(圖4).1：DNA marker(DL 2000)；2：HEK293mock；3：HEK29

15、3JNK3.圖3穩(wěn)定細(xì)胞株中JNK3的RTPCR分析結(jié)果（略）1：HEK293mock； 2:HEK293JNK3.圖4穩(wěn)定細(xì)胞株中JNK3融合蛋白的表達(dá)（略）2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡用0.2,0.5,1.0 mg/L 終濃度表阿霉素處理HEK293mock細(xì)胞的凋亡率分別為25%，31%，78%；處理HEK293JNK3細(xì)胞的凋亡率分別為38%，61%，93%. 與HEK293mock細(xì)胞相比表阿霉素能明顯促進(jìn)高表達(dá)JNK3基因的HEK293細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡（P0.05）.圖5高表達(dá)JNK3促進(jìn)表阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（略）3討論JNK信號(hào)通路是MAPK中重要的通路之一. 由

16、JNK1，JNK2和JNK3成員組成，JNK1和JNK2在組織廣泛表達(dá)，JNK3局限在大腦、心臟和睪丸表達(dá). 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)JNK3在帕金森綜合征、阿爾茨海默、中風(fēng)等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用2. JNK3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān). 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JNK3p54的PC12細(xì)胞，能明顯增強(qiáng)UV和紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡3. JNK3和p38促進(jìn)亞砷酸鈉誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡4. JNK3基因敲除小鼠可拮抗興奮性毒性氨基酸誘導(dǎo)的海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡5, 減少局部腦缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡 6-7.由于JNK3在組織表達(dá)非常局限，與細(xì)胞凋亡的關(guān)系又非常密切. 我們以pDBLeuJNK3質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR的方法獲

17、得人JNK3基因全長(zhǎng)，并成功地將其插入pcDNA3.1/mycHis B載體的CMV啟動(dòng)子下面，構(gòu)建了JNK3的真核表達(dá)載體. 經(jīng)PCR和酶切鑒定后，用載體通用引物測(cè)序證明序列準(zhǔn)確無(wú)誤后，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將pcDNA3.1JNK3重組載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過(guò)G418篩選建立了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，即HEK293JNK38. 以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞為對(duì)照, 用RTPCR和Western Blot方法分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)了JNK3基因的表達(dá)，結(jié)果表明重組人JNK3基因在HEK293細(xì)胞中能被有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，表明構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)JNK3細(xì)胞株成功. 以表阿霉素作為凋亡誘導(dǎo)劑，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H

18、EK293細(xì)胞對(duì)照相比表阿霉素能明顯促進(jìn)高表達(dá)JNK3基因的HEK293細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究JNK3促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制提供了細(xì)胞模型.【參考文獻(xiàn)】 1 Gupta S, Barrett T, Whitmarsh AJ, et al. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factorsJ. EMBO J, 1996, 15(11):2760-2770. 2 Resnick L, Fennell M. Targeting JNK3 for the treatment of neuro

19、degenerative disordersJ. Drug Discov Today, 2004,9(21): 932-939. 3 Waetzig V, Herdegen T. A Single cJun Nterminal Kinase Isoform(JNK3p54)Is an Effector in Both Neuronal Differentiation and Cell DeathJ. J Biol Chem, 2003, 278(1):567-572. 4 Namgung U, Xia Z. Arseniteinduced apoptosis in cortical neurons is mediated by cJun Nterminal protein kinase 3 and p38 mitogenactivated protein kin