骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中TGF┐β1mRNA的基因表達(dá)

1、骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中TGF1 mRNA的基因表達(dá)【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松 關(guān)鍵詞: 骨質(zhì)疏松;骨折;轉(zhuǎn)化生長因子;核酸雜交 摘 要:目的 探討型骨質(zhì)疏松骨折愈合的病生機制，檢測骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中TGF-1 mRNA的基因表達(dá)模式及細(xì)胞定位. 方法 利用去勢SD大鼠造成型骨質(zhì)疏松及其骨折模型，通過原位雜交、斑點雜交檢測骨痂局部TGF-1 mRNA的表達(dá). 結(jié)果 骨質(zhì)疏松骨折與正常骨折愈合過程中TGF-1 mRNA基因表達(dá)的細(xì)胞定位未見差別;TGF-1 mRNA表達(dá)的變化模式與正常骨折愈合過程相似. 結(jié)論 TGF-1基因表達(dá)的改變與骨質(zhì)疏松骨折愈合的病生改變未見關(guān)聯(lián). Keywords:ost

2、eoporosis;fractures;transforming growth fac-tor beta;nucleic acid hybridization Abstract:AIM To assess the changes of gene expression of the transform growth factors-1 in the process of the healing of the osteoporotic fracture in ovariectomized female SD rats.METHODS Ovariectomized female SD rats we

3、re used as model of type I osteoporosis and osteoporotic fracture and the changes of gene expression of the transforming growth fac-tors-1 were detected in the process of the healing of the os-teoporotic fracture through in situ and blot hybridization.RESULTS There was no difference of the cellular

4、localiza-tion in TGF-2 / 131 expression between the processes of the nor-mal and osteoporotic bone healing by in situ hybridization;The pattern of the gene expression of TGF-1 mRNA wassimilar to the normal in the process of the osteoporotic bone healing by dot blot hybridization.CONCLUSION Expres-si

5、on of TGF-1 mRNA is not related to the pathophysiological changes in the process of osteoporotic bone healing. 0 引言 轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-）是骨組織中含量最豐富的細(xì)胞生長因子之一1 ，它既具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，刺激骨形成，又具有支持破骨細(xì)胞形成，刺激骨吸收的雙重作用，是骨形成與骨吸收之間重要的偶聯(lián)調(diào)節(jié)因子2，3 .另外，TGF-在骨折愈合過程的不同時期具有促進(jìn)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)骨、軟骨形成及鈣化等作用4-6 .我們利用去勢SD雌性大鼠作為型骨質(zhì)疏松及其骨折模型，通過原位雜交、斑點

6、雜交，對骨質(zhì)疏松性骨折骨痂局部TGF-1 mRNA基因表達(dá)的細(xì)胞定位和表達(dá)模式進(jìn)行了研究，這有助于從基因表達(dá)水平深入了解骨質(zhì)疏松骨折愈合的病生機制. 1 材料和方法 1.1 動物模型的建立 所有實驗動物選用純種Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，體質(zhì)量在250450g（本校實驗動物中心提供），鼠齡69mo，共120只，隨機分為骨質(zhì)疏松組（OVX）及假手術(shù)對照組（Sham），每組隨機分為骨折組及非骨折對照組;骨折組以骨折后1，4，9，13及28d又各分為5組，每組均10只.10g L-1 戊巴比妥鈉（40mg kg-1 ）ip麻醉下經(jīng)背側(cè)切口，OVX組行雙則卵巢切除術(shù)，Sham手術(shù)組做

7、雙側(cè)卵巢暴露，即關(guān)閉切口.術(shù)后2mo，骨折組動物ip麻醉下先用0.5mm齒科鋼絲行脛骨髓腔內(nèi)固定術(shù)，后用專用大鼠骨折器，于大鼠雙側(cè)脛骨中段造成閉合性骨折.分別于1，4，9，13及28d時間段無菌條件下取材，一側(cè)標(biāo)本多聚甲醛固定、復(fù)合脫鈣液脫鈣、石蠟包埋，0.5m切片用于原位雜交;另側(cè)標(biāo)本直接放入液氮冷凍保存，用于總RNA提取.取材范圍包括兩骨折端及其間組織. 1.2 原位雜交 TGF-1 cDNA探針購于北京醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，探針標(biāo)記按地高辛標(biāo)記及檢測試劑盒（寶靈曼公司）說明進(jìn)行.組織切片脫蠟，0.2mol L-1 鹽酸處理5min，蛋白酶K（10mg L-1 ）消化10min，雜交探針濃度

8、為30050ng mL-1 ，42恒溫雜交1016h.1 5000封閉液稀釋酶標(biāo)地高辛抗體2h，顯色10min，蒸溜水沖洗2min，封片鏡檢. 1.3 總RNA的提取 組織塊質(zhì)量（1g），搗碎加鹽酸胍組織裂解液10mL，加5mL L-1 十二烷基肌氨酸鈉勻漿1min，離心收上清入新管，加入0.1體積3mol L-1 醋酸鈉，加等體積水平衡酚及0.2體積氯仿異戊醇，12000r min-1 離心10min，加入0.6體積異丙醇10min，12000r min-1 離心10min，700mL L-1 乙醇洗滌真空抽干，100L DEPC水溶解，取6L加水至600L，紫外分光光度計測定RNA含量.

9、圖1 圖6 略 1.4 斑點雜交 硝酸纖維素膜8cm×10cm兩張，鋪膜于真空抽吸打點儀上，加等體積RNA變性液于RNA液中（RNA濃度1g L-1 ）變性1h，點膜，每一標(biāo)本樣品為一個點，每點總RNA量為4g，室溫干燥，80干烤2h，冷卻至室溫，將2張硝酸纖維素膜分別裝入塑料袋，倒入預(yù)雜交液10mL，42預(yù)雜交16h，按濃度1560g L-1 加入變性的Dig標(biāo)記TGF-1 cDNA探針，42雜交20h，1 5000封閉液稀釋酶標(biāo)地高辛抗體10mL孵育30min，顯色液中顯色16h，薄層掃描儀掃描半定量測定. 1.5 實驗對照 正常對照:采用正常及骨質(zhì)疏松非骨折組動物的脛骨及其周圍

10、軟組織切片進(jìn)行雜交反應(yīng);空白對照:采用未加探針雜交液進(jìn)行雜交反應(yīng). 統(tǒng)計學(xué)處理:骨折組同一時間點組間數(shù)據(jù)及同組不同時間點數(shù)據(jù)通過SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），非骨折組OVX與Sham組間數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)t檢驗. 2 結(jié)果 2.1 原位雜交結(jié)果 正常骨折與骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中TGF-1 mRNA基因表達(dá)的細(xì)胞定位無差別，且表達(dá)模式基本相似.TGF-1 mRNA主要定位于軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞.急性創(chuàng)傷反應(yīng)期:TGF-1 mRNA未見表達(dá)（Fig1）;骨膜下成骨期:TGF-1 mRNA在骨膜下的成骨細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)（Fig2）;軟骨形成期:軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞內(nèi)TGF-1 mR

11、NA均有表達(dá)（Fig3）;軟骨鈣化期:TGF-1 mR-NA在鈣化前緣兩側(cè)的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，且呈高表達(dá)（Fig4）. 2.2 斑點雜交結(jié)果 正常及骨質(zhì)疏松骨折愈合的斑點雜交結(jié)果分別見Fig5，6.根據(jù)薄層掃描儀掃描所得光密度值（A）（x ±s），每個樣本mRNA含量按如下公式計算:每個樣本mRNA含量=斑點光密度值×每個樣本mRNA總量（g），見Tab1. 表1 正常骨折組不同時間段的A值略 3 討論 TGF-1 在正常骨折愈合中的調(diào)節(jié)作用已有相關(guān)研究，Joyce等7 的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脛骨骨折愈合的第一階段，TGF-1 主要來源于血小板的脫顆粒作用，并認(rèn)為是

12、啟動骨折愈合過程的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一.第二階段，主要定位于間充質(zhì)細(xì)胞和膜內(nèi)成骨中的成骨細(xì)胞;在第三階段，主要定位于間充質(zhì)細(xì)胞、幼稚及成熟的軟骨細(xì)胞;在第四階段，僅在靠近鈣化前緣的肥大軟骨細(xì)胞中有TGF-1 mRNA少量表達(dá).Noth-ern bloting檢測證明在骨折后第13日TGF-1 mR-NA的表達(dá)量達(dá)到高峰.我們的實驗提示，正常骨折愈合過程中，在不同時間點，TGF-1 mRNA的表達(dá)高峰在第13日，且與1，4及28d相比有顯著性差異（P<0.05），其表達(dá)模式與Joyce等的實驗結(jié)果相符合.有關(guān)骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中相關(guān)細(xì)胞因子改變的研究資料較少.現(xiàn)已知:TGF-1 對

13、骨形成和骨吸收具有雙向作用;實驗表明8 ，無論骨源性或血小板源性TGF-均可雙向性地刺激胎鼠顱骨及胎牛骨成骨細(xì)胞系DNA的合成，其合成率隨TGF-的增加而出現(xiàn)上升、峰值、下降三個過程.且這種反應(yīng)與細(xì)胞的分化程度關(guān)系密切，即分化程度越高，反應(yīng)越差.骨膜下注射TGF-既可刺激膜內(nèi)成骨，又可刺激軟骨內(nèi)成骨9 .TGF-除具有促進(jìn)骨形成的作用外，尚具有刺激骨吸收的作用.有實驗表明，TGF-1 可以自分泌機制刺激人類白血病細(xì)胞系向破骨樣細(xì)胞的分化，且這種作用可被TGF-1 抗體所抑制.我們的實驗提示，在骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中TGF-1 mRNA在表達(dá)模式上與正常組均相似，同一時間點其表達(dá)量的均數(shù)與正常

14、骨折組相比均高，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異.不同時間點，其峰值也出現(xiàn)在骨折后第13日，且與第1，4，28日有顯著性差異（P<0.05）.由于骨折后第13日正處于骨折愈合的軟骨成熟及軟骨內(nèi)鈣化期11 ，TGF-1 的高表達(dá)是否與軟骨鈣化期的出現(xiàn)相關(guān)，尚需進(jìn)一步的研究證實.TGF-1 的基因表達(dá)無論從細(xì)胞定位或表達(dá)量方面，與正常組相比則無明顯改變，提示TGF-1 與型骨質(zhì)疏松骨折愈合過程中的病生改變無關(guān)聯(lián). 參考文獻(xiàn): 1Carrington LJ，Roborts AB，F(xiàn)landers KC，Roche NC，Reddi AH.Accumulation，localization，and

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