EB病毒BARF1基因表達對胃癌細(xì)胞株SGC7910生物學(xué)行為的影響

1、EB病毒BARF1基因表達對胃癌細(xì)胞株SGC7910生物學(xué)行為的影響 作者：李友瓊， 張雪怡， 曾健 陳巧林 李良菊， 成靜， 訾瑞峰， 周天戟【摘要】 目的： 了解EB病毒BARF1基因表達對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法： 構(gòu)建pSG5/BARF1真核表達載體，轉(zhuǎn)染到EB病毒陰性的胃癌細(xì)胞系SGC7901，經(jīng)RTPCR鑒定，獲得BARF1穩(wěn)定表達的細(xì)胞克隆。以pSG5空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照，進行細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實驗、細(xì)胞增殖實驗、軟瓊脂集落形成實驗和細(xì)胞遷移實驗。結(jié)果： 與對照組相比，BARF1表達細(xì)胞組經(jīng)抗癌藥順鉑誘導(dǎo)后的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01），增殖速度顯著加快（P&

2、amp;lt;0.01），軟瓊脂集落形成率顯著提高（P<0.05），細(xì)胞遷移能力顯著增強（P<0.05）。結(jié)論： BARF1基因能夠全面增強胃癌細(xì)胞的腫瘤原性，可能在EB病毒相關(guān)胃癌發(fā)生與演化的整個過程中起重要作用。 【關(guān)鍵詞】 EB病毒； BARF1； 胃癌細(xì)胞； 細(xì)胞生物學(xué)行為 Abstract Objective: To investigate the oncogenic functions of EBVencoded BARF1 gene in gastric epithelial cells.Methods： A pSG5/BARF1 expression

3、 vector was constructed and transfected into an EBV negative and moderately2 / 24differentiated gastric cancer cell line SGC7901.The stably transfected cell clones were generated by limiting dilution and G418 screening, and BARF1 expression was confirmed by RTPCR.The biological behavior analysis wer

4、e conducted including cell survive curve drawing and apoptosis observation after Hoechst33342 staining induced by anticancer drug diamminedichloroplatinum(DDP), cell growth curve drawing, softagar colony formation assay, as well as cell migration test under the control of vacant pSG5 vector transfec

5、ted clones. Results： BARF1 expression in gastric cancer cells led to more resistant to apoptosis induced by DDP, faster proliferation, higher colony formation rate in soft agar, and stronger migration capability. Conclusion： BARF1 gene had all around oncogenic ability in gastric epithelial cells and

6、 may play an important role in the whole process of occurring and promoting EBVassociated gastric carcinoma. Key words EpsteinBarr virus; BARF1; gastric cancer; cell biological behavior EB病毒（EpsteinBarr virus, EBV）屬于人皰疹病毒，與多種惡性腫瘤相關(guān)，如Burkitt 淋巴瘤（BL）、Hodokin病、鼻咽癌以及胃癌等。約2%16%的胃腺癌組織中可檢測到EB病毒潛伏感染所表達的EB病毒

7、編碼的小RNA（EBERs），稱為EB病毒相關(guān)胃癌（EBVaGC）1。BARF1是EB病毒編碼的癌基因，約90病毒相關(guān)胃癌組織中可檢測到BARF1蛋白2, 3，但其在病毒相關(guān)胃癌發(fā)生中的作用尚不十分清楚。我們采用BARF1真核表達載體轉(zhuǎn)染的方法，建立BARF1穩(wěn)定表達的胃癌細(xì)胞系，全面探討B(tài)ARF1基因表達對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而初步了解其在EB病毒相關(guān)胃癌細(xì)胞中的致癌作用。 1 材料和方法 1.1 細(xì)胞株、引物、質(zhì)粒及實驗材料 EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細(xì)胞系B958和人胃癌細(xì)胞系SGC7901為中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。所用引物根據(jù)文獻4，5合成，見表1，其中引物1為克隆用，引物2為鑒

8、定用。 引物合成及DNA序列測定委托上海生工生物工程公司進行。改良pSG5真核表達載體用PshB I從pcDNA3載體上切下新霉素抗性（Neor）表達單元，插入到pSG5的Nde I位點為日本北海道大學(xué)遺傳醫(yī)學(xué)研究所腫瘤病毒室高田賢藏教授惠贈。pGEMT Easy TA克隆載體購于Promega公司，質(zhì)粒和真核細(xì)胞DNA提取和瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒購于Axygen公司。限制性DNA內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶及DNA去磷酸化試劑盒購于TaKaRa生物工程公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，RPMI1640和DMEM培養(yǎng)

9、基、G418和真核細(xì)胞RNA提取試劑Trizol購于Gibco公司。新生牛血清（NCS）購于民海生物工程公司。RTPCR試劑盒購于Toyobo公司。細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞遷移實驗用Transwell小室購于Corning公司。表1 引物序列 1.2 BARF1穩(wěn)定表達細(xì)胞克隆的獲得與鑒定 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) B958 使用RPMI1640，SGC7901使用DMEM，均添加10 NCS，100 U/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素，培養(yǎng)于37，5 CO2環(huán)境中，23 d換液1次。 1.2.2 pSG5/BARF1真核表達載體的構(gòu)建 提取B958細(xì)胞DNA作為模板，用PCR擴增BARF1的ORF4

10、。產(chǎn)物長度為697 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，然后連接到pGEMT Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌（E.coli）DH5并進行藍白篩選，挑選白色菌落擴增后提取質(zhì)粒，EcoR 酶切后，電泳回收715 bp片段。pSG5載體同樣酶切并去磷酸化后，與該片段連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5，挑取菌落擴增提取質(zhì)粒，酶切鑒定插入方向，并進行DNA序列測定。 1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與克隆 pSG5/BARF1及pSG5對照質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作按說明書進行。用有限稀釋法進行克隆，轉(zhuǎn)染后第3天將細(xì)胞消化分散，按每孔100個細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。整個過程用含300 g/ml G

11、418的培養(yǎng)液進行篩選培養(yǎng)，每周換液一次，直至長出抗性克隆，然后擴大培養(yǎng)。 1.2.4 BARF1表達鑒定 采用RTPCR進行。用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，操作按說明書進行。然后用PCR擴增BARF1 ORF內(nèi)部一段序列5，產(chǎn)物用1.5瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀中攝影。選取3個表達量相對較高的克隆進行細(xì)胞生物學(xué)行為的觀察，并隨機抽取3個pSG5轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆作為對照。 1.3 細(xì)胞生物學(xué)行為的觀察 1.3.1 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)實驗 處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化分散后，配成1.5×106/ml細(xì)胞懸液，按每孔150 l接種于96孔板， 24 h后加入終濃度為15 g/ml的

12、順鉑（DDP）繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h將細(xì)胞消化分散，經(jīng)臺盼藍染色后進行計數(shù)。然后以時間為橫軸，細(xì)胞存活率為縱軸，繪制細(xì)胞存活曲線。DDP作用96 h后，去掉DDP，PBS洗2次，換加10NCS新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。DDP誘導(dǎo)24,48 h細(xì)胞用Hoechst33342進行染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。正常細(xì)胞核被染成均勻熒光，細(xì)胞核局部呈強熒光染色者則判斷為處于凋亡期的細(xì)胞。共隨機計數(shù)500個細(xì)胞，最后以凋亡細(xì)胞數(shù)除以細(xì)胞總數(shù)即為細(xì)胞凋亡率。每細(xì)胞克隆計數(shù)3個復(fù)孔。 1.3.2 細(xì)胞增殖實驗 處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化分散后，配成2.2×105/ml細(xì)胞懸液，按每

13、孔200 l接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。每24 h將細(xì)胞消化分散，臺盼藍染色后進行計數(shù)。每細(xì)胞克隆計數(shù)3個復(fù)孔，取均值。然后以時間為橫軸，活細(xì)胞數(shù)量為縱軸，繪制細(xì)胞增殖曲線。 1.3.3 軟瓊脂集落形成實驗 按文獻6方法進行。24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接種細(xì)胞4×103個，每天觀察集落形成情況，以16個以上細(xì)胞判斷為一個集落，培養(yǎng)至第15天計數(shù)集落數(shù)并測量集落大小。在100倍顯微鏡下每孔隨機計數(shù)5個視野，每細(xì)胞克隆做3個復(fù)孔。 1.3.4 細(xì)胞遷移實驗 按Corning公司說明書進行。對數(shù)生長期細(xì)胞以無血清DMEM洗滌兩次后，在含0.5 NCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞處于血清饑餓狀

14、態(tài)。次日消化收集細(xì)胞，以0.5 NCS的培養(yǎng)基配制成5×106/ml的細(xì)胞懸液，取0.1 ml加于Transwell小室上層，下層加入0.8 ml 含10 NCS的培養(yǎng)基，置37，CO2條件下培養(yǎng)。每細(xì)胞克隆做3個復(fù)孔，分別于6，12 和24 h后取出，擦去上層細(xì)胞，10甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min后，于100倍顯微鏡下觀察， 隨機取5個視野計數(shù)下層細(xì)胞。 1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較采用2檢驗。 2 結(jié) 果 2.1 pSG5/BARF1表達載體的鑒定 pSG5/BARF1全長6.5 kb，EcoR 酶切后應(yīng)水解為5.8 kb和0.72 kb

15、兩個片段，結(jié)果與預(yù)期相吻合（圖1）。DNA測序結(jié)果100符合。 2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞BARF1表達的鑒定 pSG5/BARF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的BARF1 mRNA檢測為陽性，而載體轉(zhuǎn)染對照為陰性（圖2）。 2.3 細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的存活曲線 培養(yǎng)液中加入15 g/ml DDP后即迅速誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡， 但BARF1表達細(xì)胞的存活率下降速度較對照組慢，48 h時差異已較為顯著（P<0.01），至96 h時pSG5對照組存活細(xì)胞數(shù)已下降至原來的12.2，而BARF1組尚有40.6（圖3）。 2.4 Hoechst33342染色 Hoechst33342染色后可見兩組細(xì)胞均有凋亡情況發(fā)生，但BAR

16、F1組比空載體組凋亡率低，24 h后即有明顯差異，48 h后差異更為顯著（圖4）。 2.5 細(xì)胞增殖實驗 從細(xì)胞增殖曲線可以看出，BARF1表達的細(xì)胞增殖速度明顯快于對照組，至第4天差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），第5天起有極顯著意義（P<0.01）。培養(yǎng)第5天對照組活細(xì)胞數(shù)已達最高，隨后開始下降。而BARF1表達細(xì)胞至第6天細(xì)胞總數(shù)仍在繼續(xù)增加（圖5）。按第3和第5天之間計算2組細(xì)胞的倍增時間分別為24.0 h和45.4 h。 a：15 g/ml DDP 誘導(dǎo)48 h后Hoechst33342染色結(jié)果（×200，箭頭所示為典型的凋亡小體）；b：Hoec

17、hst33342染色后的凋亡率統(tǒng)計；與pSG5比較，*：P<0.05; *：P<0.01 2.6 軟瓊脂集落形成實驗 培養(yǎng)8 d后，可見到BARF1表達細(xì)胞開始有集落出現(xiàn)。12 d后，BARF1組可見到較多的集落形成，細(xì)胞呈堆積性生長，一般大小約有0.51.0 m，生長狀態(tài)良好。而空載體組只看到零星的細(xì)胞，偶爾也能看到極少數(shù)的集落，但是其直徑不足0.1 m，而且細(xì)胞已經(jīng)開始死亡（圖6）。15 d后，BARF1組集落繼續(xù)增大，培養(yǎng)基pH值降低，而對照組多數(shù)細(xì)胞已開始進入死亡期（表2）。20 d后，培養(yǎng)基pH值已低于6.5，BARF1組仍有部分細(xì)胞存活，而對照組細(xì)胞已全

18、部死亡。 (a)BARF1表達細(xì)胞(b)pSG5對照細(xì)胞圖6 軟瓊脂中形成的典型集落（×200）表2 軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果 2.6 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果 BARF1組細(xì)胞遷移速度比對照組快，隨著培養(yǎng)時間的延長，差異越來越明顯，至24 h，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。表3 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果 3 討 論 BARF1基因位于EB病毒基因組BamH I A 40 kb長的片段內(nèi)，屬于EB病毒的早期基因。最近的研究表明，它在EB病毒潛伏感染狀態(tài)亦可表達2, 7。BARF1能夠誘導(dǎo)原代猴腎上皮細(xì)胞的永生化4, 8，抑制紫杉醇誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞的凋亡5，增強NP

19、C細(xì)胞的腫瘤原性9、誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞10和EB病毒陰性的人B細(xì)胞系11-13的惡性轉(zhuǎn)化，其編碼的蛋白（p31）具有很強的促有絲分裂原活性12, 14。這些研究表明，BARF1屬于EB病毒致癌基因，且在不同種類細(xì)胞中的作用可能有所差異。 本文在胃癌細(xì)胞系SGC7901上的研究發(fā)現(xiàn)，BARF1的表達能夠抑制抗腫瘤藥物DDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強細(xì)胞在惡劣條件下的存活能力。去除DDP并換加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4天后，BARF1表達細(xì)胞形態(tài)已基本恢復(fù)到誘導(dǎo)前的良好狀態(tài)并開始增殖，而對照組仍然維持誘導(dǎo)時的形態(tài)（資料未顯示）。推測，當(dāng)?shù)蛲稣T導(dǎo)因子被去除后，BARF1能幫助細(xì)胞迅速擺脫凋亡途徑，重新回到正常細(xì)

20、胞周期。BARF1的抗凋亡作用在原代猴腎上皮細(xì)胞4、胃癌細(xì)胞BGC8235、鼠成纖維細(xì)胞6中也被觀察到，而EB病毒相關(guān)胃癌組織中也觀察到細(xì)胞凋亡指數(shù)的下降15，這可能是BARF1表達的結(jié)果。一些EB病毒相關(guān)腫瘤中，對某些抗腫瘤藥物的抗性可能也與BARF1表達有關(guān)16-19。研究表明，BARF1基因的抗凋亡作用可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達從而抑制細(xì)胞凋亡通路而實現(xiàn)的。例如，BARF1轉(zhuǎn)染的鼠成纖維細(xì)胞Bcl2基因表達上調(diào)6，BARF1表達的胃癌細(xì)胞BGC823 中Bcl2/Bax比率增加，一些凋亡通路分子如半胱氨酸蛋白酶等的表達量也發(fā)生變化5。 本文結(jié)果還顯示，除了抗凋亡作用外，BARF

21、1有直接促胃上皮細(xì)胞增殖的作用。細(xì)胞增殖曲線顯示BARF1表達細(xì)胞的增殖速度明顯快于對照組，細(xì)胞倍增時間比pSG5對照減少1.9倍。在培養(yǎng)后期，隨著營養(yǎng)消耗及代謝產(chǎn)物堆積，培養(yǎng)環(huán)境逐漸變得不利于細(xì)胞生長與存活。故對照組5天后活細(xì)胞數(shù)開始下降，而BARF1組至第6天細(xì)胞總數(shù)仍在繼續(xù)增加。說明對照組細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境中的不利因素更為敏感，而BARF1能夠增強細(xì)胞抵抗環(huán)境中的凋亡誘導(dǎo)因素，促進細(xì)胞增殖，故可推遲死亡發(fā)生的時間，維持更長時間增殖。這與Wei等4在原代猴腎上皮細(xì)胞上的研究結(jié)果相似，說明BARF1能夠直接促進上皮細(xì)胞的增殖。其機理可能與BARF1能夠活化細(xì)胞周期、上調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達和刺

22、激細(xì)胞生長因子分泌有關(guān)5, 12。Wang等5在胃癌細(xì)胞系BGC823上只觀察到BARF1的抗凋亡作用，而沒有促增殖作用，這與我們的結(jié)果不同，推測其原因可能源于細(xì)胞間的差異。大量研究表明，BARF1的功能表現(xiàn)與細(xì)胞種類有關(guān)4, 11, 13。雖然同為胃癌細(xì)胞系，BGC823為低分化惡性胃癌細(xì)胞，其生長速度可能已接近極限，故可能對BARF1表達引起的促細(xì)胞增殖相關(guān)因子不夠敏感，因而增殖速度變化不明顯。而本文所用SGC7901為中分化胃癌細(xì)胞系，惡性度相對較低，故能更好地顯示BARF1基因的生長促進作用。 軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果表明，BARF1表達細(xì)胞在軟瓊脂上形成的集落數(shù)顯著多于pSG5轉(zhuǎn)染細(xì)胞

23、，且平均體積較對照組大，在陳舊培養(yǎng)基中的存活能力較強，說明BARF1增強了SGC7901細(xì)胞的腫瘤原性。BARF1在淋巴瘤細(xì)胞中也有這種能力11，而在原代猴腎上皮細(xì)胞中雖可抵抗凋亡和促進其增殖，但在裸鼠體內(nèi)卻不能誘發(fā)腫瘤4，說明BARF1的致癌能力與細(xì)胞種類有關(guān)。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果表明，BARF1表達細(xì)胞的血清趨化遷移能力較pSG5轉(zhuǎn)染細(xì)胞增強，說明BARF1增強了SGC7901的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 一般認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個漫長而連續(xù)的過程，可以分為促發(fā)、演進、侵襲與轉(zhuǎn)移三個階段。促發(fā)階段的主要特征是細(xì)胞凋亡的抑制，演進階段細(xì)胞增殖速度進一步加快，而侵襲與轉(zhuǎn)移階段為腫瘤演化的晚期行為。本文結(jié)

24、果表明，BARF1表達能夠抑制DDP誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞增殖速度顯著加快，提高軟瓊脂中的集落形成率和細(xì)胞遷移能力。說明BARF1基因能夠全面增強胃上皮細(xì)胞的腫瘤原性，提示其可能在EB病毒相關(guān)胃癌發(fā)生與演化的整個過程中均起重要作用。Wang等5通過基因芯片分析表明，BARF1表達使胃癌細(xì)胞一些與細(xì)胞增殖、凋亡、周期、黏附等相關(guān)基因的表達量有明顯上調(diào)，也說明了BARF1基因?qū)?xì)胞狀態(tài)的影響是全面的。【參考文獻】 1 Kieff E, Rickinson AB.EpsteinBarr Virus and its replicationM.5th edition.Philadelphi

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