音樂對大鼠學(xué)習(xí)和記憶以及海馬NMDA受體表達的影響

1、音樂對大鼠學(xué)習(xí)和記憶以及海馬NMDA受體表達的影響 作者：王增賢，王曉亞，王懷經(jīng)，李振中，王越，邢子英 【Abstract】AIM： To study the effect of music on the spatial learning and memory and the expression of NMDA receptor in hippocampus of rats. METHODS: The nonmatched position task in the Morris' water maze was used to examine the behavior changes

2、of learning and memory, and immunohistochemistry and PCR techniques were employed to measure the expression of NMDA receptor and its mRNA in hippocampus in Wistar rats after music stimulation. RESULTS: After music exposure, the spatial memory of rat improved, the avoiding latency of information swim

3、 and choice swim shortened, and the choice accuracy in choice swim increased. The strongest effect of music was demonstrated in persistent music exposure group, moderate in the postnatal music exposure group, and the least in control groups. The expression of NMDA receptor and its mRNA in hippocampu

4、s strengthened. CONCLUSION: Music can improve the spatial memory of rats and increase the expression of NMDA receptor and its mRNA in hippocampus.【Keywords】 learning；memory； receptors, NMethylDAspartate； music； rats2 / 19【摘要】目的： 研究音樂對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶及海馬內(nèi)NMDA受體表達的影響.方法： 用Morris水迷宮行為檢測法，檢測音樂刺激后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化；免

5、疫組化和PCR技術(shù)，檢測海馬NMDA受體及編碼NMDA受體mRNA的表達.結(jié)果： 音樂刺激后，大鼠信息游泳和選擇游泳的逃避潛伏期縮短，選擇游泳選擇正確率提高，其變化以持續(xù)音樂刺激組最明顯，生后音樂組次之，對照組最小；音樂刺激后海馬神經(jīng)元NMDA受體及其mRNA表達增加.結(jié)論： 音樂刺激能提高大鼠空間記憶能力，增強海馬神經(jīng)元NMDA受體及編碼NMDA受體的mRNA表達.【關(guān)鍵詞】 學(xué)習(xí)；記憶；受體，N甲基D天冬氨酸；音樂；大鼠0引言學(xué)習(xí)和記憶是哺乳類動物生存的重要基礎(chǔ).參與學(xué)習(xí)和記憶的腦結(jié)構(gòu)因?qū)W習(xí)和記憶的類型不同，呈現(xiàn)出復(fù)雜的多樣性.關(guān)于化學(xué)物質(zhì)，如藥物、神經(jīng)活性物質(zhì)等對學(xué)習(xí)和記憶的作用研究，已

6、經(jīng)取得了大量的資料，但是環(huán)境對學(xué)習(xí)和記憶影響的研究資料尚少見報道.本研究中我們用Wistar大鼠，在不同的發(fā)育時期給予音樂刺激后，用位置非匹配作業(yè)在Morris水迷宮中對大鼠進行行為學(xué)檢測，并對大鼠海馬、杏仁核和中腦中央灰質(zhì)等處NMDA受體的免疫組織化學(xué)反應(yīng)強度和海馬組織編碼NMDA受體的mRNA表達進行定量檢測，以探索音樂刺激對大鼠學(xué)習(xí)和記憶以及與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)NMDA受體表達的影響，為環(huán)境因素干預(yù)學(xué)習(xí)和記憶能力的機制研究提供資料.1材料和方法11材料取定時妊娠Wistar大鼠2只，妊娠期間1只于給予音樂刺激，另1只不予音樂處理.2只大鼠分娩后，得到2窩大鼠崽各15只，分別隨機分為2組

7、： 1組給予音樂刺激，另1組不予音樂處理.胎期接受音樂刺激，生后繼續(xù)音樂刺激的，為持續(xù)音樂組（組 1），7只，另一組生后中斷音樂刺激，為生前音樂組（組3），6只；僅生后接受刺激的為生后音樂組（組2），7只，另一組從未接受音樂刺激的為對照組（組4），7只.前3組實驗中各剔除1只.各組雌雄不計.12方法121音樂刺激方案用立體聲收錄機播放中國民間音樂小提琴協(xié)奏曲梁山伯與祝英臺，每次45 min ， 2次/d，每周播放音樂5 d，休息2 d.為避免環(huán)境無關(guān)聲音影響，播放地點選在比較安靜的實驗室，并在每日實驗室無人員進出的早6：30和晚7：00進行.音樂播放期間，收錄機和大鼠的位置、音樂的強度保持恒定

8、.孕鼠音樂刺激從妊娠第8日開始，鼠崽音樂刺激從出生當天開始，直到生后70 d.122學(xué)習(xí)和記憶的行為訓(xùn)練和檢測用Morris氏水迷宮(Morris water maze)進行大鼠學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)訓(xùn)練和檢測1，2.訓(xùn)練方案為，預(yù)訓(xùn)練3 d，學(xué)習(xí)訓(xùn)練9 d，休息2 wk，檢測3 d.訓(xùn)練和檢測時，每只大鼠游泳9次/d.123免疫組織化學(xué)染色及圖像分析用兔抗NMDA受體1亞單位多克隆抗體（Santa Cruz公司，1300稀釋），對切片做SABC漂浮片方法染色標記.方法步驟概要： 01 mL/L H2O2室溫15 min，抗原封閉液室溫1 h，一抗?jié)窈袃?nèi)4過夜，羊抗兔IgG室溫2 h，SABC室溫

9、2 h，DAB顯色10 min.上述步驟中除加一抗前一步驟外，第一步和以后各步驟后都用001 mol/L PBS沖3次，每次10 min.染色完成后，常規(guī)脫水、透明、封片，觀察照相.對照組用血清代替一抗，其余步驟相同.圖像分析： 在每組所做的切片中，選取5張切片用Pro plus 圖像分析儀分析處理.對海馬組織CA1、CA3和齒狀回神經(jīng)元NMDA受體的免疫染色強度進行分析.各片上均以其胼胝體染色作為參照，求得目標區(qū)和胼胝體光密度差值后，進行統(tǒng)計學(xué)分析處理.124海馬組織NMDA受體mRNA的PCR分析取各組大鼠海馬組織，25 mg/L 胰蛋白酶消化方法分離細胞后，以cacaggagcgggta

10、aacaacagc作為上游引物，gcttcagtccctttggccgattc作為下游引物.提取總mRNA，進行反轉(zhuǎn)錄.加入上游、下游引物、actin 和Taq 酶等， 94，40 s；55，40 s；72，50 s，循環(huán)35次.用15 mL/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，SmartView生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日生物技術(shù)研制所）進行光密度分析，得出mRNA表達的相對值.統(tǒng)計學(xué)處理： 除選擇游泳中的選擇正確率用2檢驗外，其余各參數(shù)組間比較用方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理.2結(jié)果21大鼠的一般行為學(xué)觀察在音樂播放過程中，鼠崽活動減少，安靜地聚集在一起.當被放回動物房后，鼠崽活動活躍，打斗頻繁，對人的觸抓逃

11、避反應(yīng)敏感.未接受音樂刺激的鼠崽，活動、打斗較少，對觸抓反應(yīng)不很敏感.在訓(xùn)練過程中，起初大鼠游泳時沿著迷宮和隔板貼壁游動，隨著訓(xùn)練的進行，大鼠通過觀察后或直接游到平臺所在位置，所用時間逐漸縮短，選擇正確率不斷提高.22訓(xùn)練過程中大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的變化221信息游泳（information swim ,IS）逃避潛伏期訓(xùn)練初期和訓(xùn)練后期，各組IS逃避潛伏期以組1最短，以后依次為組2、組3與組4.其中組1與組2 之間沒有顯著性差別（P>005），組3與組4組之間具有顯著性差別（P<001），而組1，2與組3，4之間具有明顯的差異（P<001，Tab 1）

12、.表明音樂刺激對大鼠的空間記憶有促進作用，而且呈現(xiàn)刺激時間長，則作用明顯的傾向.表1訓(xùn)練過程中大鼠IS逃避潛伏期 （略）222選擇游泳（choice swim ，CS）逃避潛伏期訓(xùn)練初期各組的CS逃避潛伏期從短到長依次為： 組1，2，3和組4，其中組1，2之間沒有顯著性差異（P>005），組3，4間也沒有顯著性差異（P>005），而組1，2與組3，4 之間具有顯著性差異（P<001，Tab 2）；CS選擇正確率，初期從高到低依次為組1，2，3和組4，組1與組2之間沒有顯著性差別（P>005），組3與組4之間具有顯著性差別（P&lt

13、;001），組1，2與組3，4之間具有顯著性差別（P<001）.后期結(jié)果與初期類似（Tab 3）.表明，音樂刺激可以促進工作記憶的形成和提高，而且呈現(xiàn)刺激時間依賴性，即刺激時間長，則促進作用明顯.表2訓(xùn)練過程中大鼠CS逃避潛伏期（略）表3訓(xùn)練過程中大鼠CS選擇正確率（略）23大鼠學(xué)習(xí)和記憶訓(xùn)練的檢測結(jié)果訓(xùn)練后大鼠經(jīng)過1 wk的休息再行3 d的檢測.231IS逃避潛伏期檢測期間大鼠的IS逃避潛伏期依次為 (605±451) s(組1)、(616±338) s(組2)、(818±503 ) s (組3)、(972±725 ) s (組4)，與訓(xùn)

14、練末期相比都有所延長，但不具有顯著性差異.其中前兩組間沒有顯著性差異（P>005），后兩組間具有顯著性差異（P<001），前兩組與后兩組間具有顯著性差異（P<001）.表明大鼠經(jīng)過訓(xùn)練已經(jīng)學(xué)會了IS，且音樂刺激對大鼠空間記憶能力的影響作用依然存在.232CS逃避潛伏期檢測期間各組大鼠的CS逃避潛伏期為(837±503 ) s (組1)、(830±338) s (組2)、(982±551) s (組3)、(1013±725) s (組4)，與訓(xùn)練末期相比，無明顯差異，檢測期間各組間仍是前兩組和后兩組之間具有顯著性差

15、異.表明音樂刺激引起的大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的差別仍然存在.CS選擇正確率在檢測期間分別為8575% (組1)、8146% (組2)、68.74% (組3)、6236% (組4)，與訓(xùn)練末期沒有顯著增減，但前兩組和后兩組間仍然具有顯著性差異.24大鼠腦組織NMDA受體表達音樂刺激后大鼠海馬NMDA受體免疫反應(yīng)強度以音樂組最強，其次為生后音樂組，再次為胎期音樂組和對照組（Tab 4）.并且，音樂組和生后音樂組顯著地高于胎期音樂組和對照組，而音樂組和生后音樂組之間、胎期音樂組和對照組之間均沒有顯著差異.表明音樂刺激能提高海馬NMDA受體的表達（Fig 1，2），并且只有在生后進行音樂刺激才能起作用，胎

16、期刺激沒有作用.25大鼠海馬組織NMDA受體mRNA表達NMDA受體mRNA在大鼠海馬組織表達強度從強到弱依次為: 音樂組、生后音樂組、胎期音樂組和對照組，與NMDA受體免疫反應(yīng)強度變化順序相似（Tab 4，F(xiàn)ig 3），表達的高峰值時間前移，并且也是音樂組和生后音樂組顯著地高于胎期音樂組和對照組，音樂組和生后音樂組之間、胎期音樂組和對照組之間均沒有顯著差異. 表4海馬組織NMDA受體免疫反應(yīng)強度光密度及其mRNA表達的半定量結(jié)果（略）3討論學(xué)習(xí)和記憶是一個非常復(fù)雜的神經(jīng)過程，腦內(nèi)許多結(jié)構(gòu)參與學(xué)習(xí)的不同過程，并與不同的學(xué)習(xí)方式相關(guān)聯(lián).海馬被認為是人和高等動物學(xué)習(xí)和記憶不可缺少的神經(jīng)結(jié)構(gòu)之一.在

17、嚙齒類動物，海馬是空間位置關(guān)系的重要“編碼器”，編碼位置和時間之間的聯(lián)系，在空間航行探索中發(fā)揮重要作用3，4.在人類的學(xué)習(xí)和記憶過程中，海馬參與記憶的編碼和再現(xiàn)的加工過程5，且海馬不同部位所發(fā)揮的作用不同.音樂對中樞神經(jīng)系統(tǒng)高級功能活動的影響通過多種不同的機制實現(xiàn).首先，音樂刺激能擴大腦內(nèi)相關(guān)功能代表區(qū)，提高神經(jīng)功能活動.長期音樂訓(xùn)練引起大腦皮質(zhì)體感和聽覺皮質(zhì)代表區(qū)擴大，而且這種影響是音樂刺激特異性的，正弦聲波刺激并不引起這種變化5；其次，音樂刺激可改變腦電活動，從而影響腦的高級功能活動.深部腦電圖研究顯示，人海馬對不同音樂刺激有不同反應(yīng)6；音樂刺激還通過改變神經(jīng)活動發(fā)揮作用.研究顯示，少年時

18、期接受音樂刺激者，其單詞的記憶能力比沒有接受過訓(xùn)練者顯著增強7，同時聆聽歌曲可以增強健忘癥患者的學(xué)習(xí)和記憶能力8；第四，音樂刺激可以調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)某些物質(zhì)的表達狀態(tài)，改變神經(jīng)系統(tǒng)的功能.生前給予音樂刺激的小雞，其腦內(nèi)嘴內(nèi)側(cè)紋狀體/下丘腦腹下區(qū)鈣結(jié)合蛋白小清蛋白（PV）和CaBP在神經(jīng)元內(nèi)表達增加，同時核內(nèi)表達該兩種物質(zhì)的神經(jīng)元比例增加8.我們觀察到，音樂刺激可以提高大鼠的空間參考記憶和工作記憶能力，音樂對大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的提高依賴于音樂刺激的作用時間，音樂刺激作用時間長則提高明顯.反復(fù)訓(xùn)練也可以提高大鼠的空間參考記憶和工作記憶能力，并具有時間依賴性.音樂刺激引起海馬NMDA受體及編碼該受體的m

19、RNA表達增加.表明海馬參與了音樂促進大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力提高的過程，而這種能力提高與NMDA受體表達上調(diào)有關(guān).【參考文獻】1 Frick KM, Price DL, Koliatsos VE, et al. The effects of nerve growth factor on spatial recent memory in aged rats persist after discontinuation of treatment J. Neuroscience，1997；17（7）：2543-2550.2 Markowska AL, Price D, Koliatsos VE. Sele

20、ctive effects of nerve growth factor on spatial recent memory as assessed by a delayed nonmatchingtoposition task in the water mazeJ. Neuroscience，1996；16（10）：3541-3548.3 Buzsaki G，Chen LS，Goge FH. Spatial organization of physiological activity in the hippocampal region： Relevance to memory formationJ. Prog Brain R