基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實驗 8-目的基因的PCR擴(kuò)增及其擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定講解學(xué)習(xí)

1、基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實驗 8-目的基因的PCR擴(kuò)增及其擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定此實驗共包括如下六個部分此實驗共包括如下六個部分第一部分，目的基因選擇第一部分，目的基因選擇第二部分，第二部分，PCRPCR引物設(shè)計引物設(shè)計第三部分，第三部分，PCRPCR實驗操作實驗操作第四部分，第四部分，PCRPCR產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定第五部分，第五部分，PCRPCR產(chǎn)物測序鑒定產(chǎn)物測序鑒定1.1. 第六部分，目的基因序列變異分析第六部分，目的基因序列變異分析 第一部分，目的基因選擇第一部分，目的基因選擇候選基因簡介候選基因簡介在本實驗中，有三個候選基因，分別是在本實驗中，有三個候選基因，分別是NGAL，F(xiàn)ascin和和Ezrin

2、。這三個基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達(dá)，說明它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展這三個基因在食管癌及其他多種腫瘤中呈過表達(dá)，說明它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的生物學(xué)作用。中起重要的生物學(xué)作用。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組曾對這三個基因進(jìn)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組曾對這三個基因進(jìn)行了深入研究，在國外雜志上發(fā)表行了深入研究，在國外雜志上發(fā)表SCI收錄研究論文收錄研究論文20余篇，已形成系列優(yōu)勢。余篇，已形成系列優(yōu)勢。同學(xué)們可查閱相關(guān)資料，選擇感興趣的基因來做同學(xué)們可查閱相關(guān)資料，選擇感興趣的基因來做PCR實驗。實驗。NGAL（neutrophil gelat

3、inase-associated lipocalin）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載）即中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白，是脂質(zhì)運載蛋白（蛋白，是脂質(zhì)運載蛋白（lipocalin) 家族的一個成員。家族的一個成員。 NGAL基因的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶基因的蛋白產(chǎn)物具有保護(hù)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)的活性，作為小分子鐵配合物結(jié)合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外，合蛋白參與機(jī)體鐵代謝和天然免疫反應(yīng)等功能。另外，NGAL作為一種早期標(biāo)志物還可作為一種早期標(biāo)志物還可以幫助判定缺血性腎損傷程度。以幫助判定缺血性腎損傷程度。 NGAL的的mRNA信息在信息

4、在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含完核酸數(shù)據(jù)庫中有來自不同實驗室登記的多個版本，包含完整編碼區(qū)的有整編碼區(qū)的有BC033089和和NM_005564等，編碼區(qū)長為等，編碼區(qū)長為597 bp，編碼，編碼198個氨基酸，包含個氨基酸，包含了了N端前部長為端前部長為20個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的個氨基酸的信號肽序列（為核酸序列的1-60 bp）。）。NGAL 基因基因NGAL核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列核酸編碼區(qū)序列及其相應(yīng)的蛋白序列：前前20個個AA為信號肽序為信號肽序列列2001年汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細(xì)胞年汕頭大

5、學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室李恩民課題組以永生化食管上皮細(xì)胞系系SHEE 和食管癌細(xì)胞系和食管癌細(xì)胞系SHEEC 互為對照，用互為對照，用cDNA 微列陣進(jìn)行篩選，用微列陣進(jìn)行篩選，用RNA 印跡和印跡和RT-PCR 進(jìn)行鑒定，進(jìn)行鑒定，cDNA 克隆測序后與克隆測序后與GenBank 進(jìn)行進(jìn)行BLAST 分析比較。結(jié)果表明分析比較。結(jié)果表明NGAL 基基因在因在SHEEC中出現(xiàn)顯著差異過表達(dá)，其中出現(xiàn)顯著差異過表達(dá)，其cDNA 序列與小鼠序列與小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu-related lipocalin) 和人中性粒細(xì)胞和人中性粒細(xì)胞NGAL 具有較高的相似性。這提示具

6、有較高的相似性。這提示NGAL 基因在永生化食管上皮基因在永生化食管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的癌基因或促癌基因。細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA 芯片篩選兩種細(xì)胞的差異表達(dá)基因芯片篩選兩種細(xì)胞的差異表達(dá)基因A.永生化食管上皮細(xì)胞系永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE B.食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系SHEEC A B C反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR檢測檢測NGAL在兩種細(xì)胞的在兩種細(xì)胞的mRNA水平水平A.永生化食管上皮細(xì)胞系永生化食管上皮細(xì)胞系SHEE B.食管癌細(xì)胞系食管癌細(xì)胞系SHEECC. 100 bp DNA markerFa

7、scin蛋白的蛋白的mRNA全長為全長為2767bp，由，由5端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)111bp堿基，堿基，3端非翻譯區(qū)端非翻譯區(qū)1174bp堿基，堿基，1482bp的全編碼序列區(qū)和的全編碼序列區(qū)和6個個PloyA信號肽組成，編碼信號肽組成，編碼493個氨基酸，分子量約個氨基酸，分子量約為為55kD。Fascin蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶(ruffles)，邊緣的絲狀偽足，邊緣的絲狀偽足(filopodia)、微棘微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中。的核心肌動蛋白束中。以往研究發(fā)現(xiàn)，以往研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascin基因在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞系

8、，如宮頸癌基因在許多上皮來源的腫瘤細(xì)胞系，如宮頸癌Hela、胃癌、胃癌AGS、大腸癌大腸癌LM1215和和SW480、胰腺癌、胰腺癌BxPC3和和T3H4等細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)。等細(xì)胞系中均上調(diào)表達(dá)。細(xì)胞的絲狀偽足和微棘與細(xì)胞的運動，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示細(xì)胞的絲狀偽足和微棘與細(xì)胞的運動，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，提示Fascin蛋白可蛋白可能在細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用。能在細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞間信息交流等過程中發(fā)揮作用。Fascin 基因基因ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCG

9、GCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGT

10、CCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCA

11、AGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCA

12、CCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACG

13、ATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDG

14、NVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELF

15、LMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascin基因的編碼區(qū)序列基因的編碼區(qū)序列Fascin基因的蛋白序列基因的蛋白序列Fascin蛋白的三級結(jié)構(gòu)：由蛋白的三級結(jié)構(gòu)：由4個個-三葉草結(jié)構(gòu)組成，含多個三葉草結(jié)構(gòu)組成，含多個折疊折疊我們課題組發(fā)現(xiàn)，在永生化食管上皮細(xì)胞我們課題組發(fā)現(xiàn)，在永生化食管上皮細(xì)胞SHEE向食管癌細(xì)胞向食管癌細(xì)胞SHEEmt的惡性轉(zhuǎn)化中，的惡性轉(zhuǎn)化中，F(xiàn)ascin基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，

16、并且在食管癌組織中也檢測到基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且在食管癌組織中也檢測到Fascin蛋白呈陽性表達(dá)。蛋白呈陽性表達(dá)。Fascin在食管癌中的具體功能以及過表達(dá)的機(jī)制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們在食管癌中的具體功能以及過表達(dá)的機(jī)制至今仍沒有得到很好的闡明。為此我們設(shè)計并合成了靶向設(shè)計并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA，試圖通過，試圖通過RNA干擾的方法減少干擾的方法減少Fascin基因的表基因的表達(dá)，從而探討達(dá)，從而探討Fascin對腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤等生物學(xué)行為的影響。對腫瘤的分化、分裂增殖和浸潤等生物學(xué)行為的影響。掃描電鏡結(jié)果顯示抑制掃描電鏡結(jié)果顯示抑制Fascin表

17、達(dá)后，表達(dá)后，EC109細(xì)胞突觸形成明顯減少。細(xì)胞突觸形成明顯減少。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示代表細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示代表Fascin蛋白的綠色熒蛋白的綠色熒光在被干擾細(xì)胞（光在被干擾細(xì)胞（A）中要比對照細(xì)胞（）中要比對照細(xì)胞（B）的弱）的弱ABEzrin基因基因Ezrin為為ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成員之一，）蛋白家族成員之一，ERM家族成員大多位于絲狀突家族成員大多位于絲狀突和膜伸展部位，基本功能就是將肌動蛋白栓系到細(xì)胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位，這和膜伸展部位，基本功能就是將肌動蛋白栓系到細(xì)胞膜和將膜蛋白錨定在特定的部位，這樣可維持細(xì)胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu)

18、，如微絨毛和細(xì)胞膜突起等。樣可維持細(xì)胞膜表面的一些特殊結(jié)構(gòu)，如微絨毛和細(xì)胞膜突起等。ERM家族蛋白還參與細(xì)胞表面粘附分子的定位，通過細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互家族蛋白還參與細(xì)胞表面粘附分子的定位，通過細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用參與細(xì)胞粘附作用降。作用參與細(xì)胞粘附作用降。ERM家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體，并通過家族蛋白還是酪氨酸激酶的受體，并通過Rho-GTP酶參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。酶參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ezrin含有含有585個氨基酸，等電點為個氨基酸，等電點為6.15，理論分子量為，理論分子量為69kD。Ezrin分子帶有大量電荷分子帶有大量電荷（38.5%的氨基酸殘基帶電荷），這可能是

19、導(dǎo)致它的理論分子量與實際分子量不同的原因的氨基酸殘基帶電荷），這可能是導(dǎo)致它的理論分子量與實際分子量不同的原因（Ezrin實際分子量為實際分子量為80kD）。）。Ezrin定位與染色體定位與染色體6q25.2-q26，DNA長度為長度為1761個堿基，含個堿基，含13個外顯子。個外顯子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAAT

20、AAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTG

21、ATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGAC

22、AAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCATCAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAG

23、GACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCC

24、CAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGCTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATC

25、ATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAAEzrin的編碼區(qū)序列的編碼區(qū)序列Ezrin蛋白含有四個功能域蛋白含有四個功能域名稱名稱起始起始終點終點功能功能FERM_N 986將胞漿蛋白連接到膜上將胞漿蛋白連接到膜上FERM_M 88206FERM_C 210299ERM 338586結(jié)合胞漿蛋白結(jié)合胞漿蛋白我們課題組發(fā)現(xiàn)我們課題組發(fā)現(xiàn)Ezrin在食管癌及切緣食管粘膜組織中的位置分布有胞膜分布、胞漿分在食管癌及切緣食管粘膜組織中的

26、位置分布有胞膜分布、胞漿分布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細(xì)胞越易具有胞漿分布模式，說布和胞膜胞漿混合分布等三種模式。惡性程度越高的癌細(xì)胞越易具有胞漿分布模式，說明明Ezrin細(xì)胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞定位的變化可能在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。第二部分，第二部分，PCR引物設(shè)計引物設(shè)計引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。目前有多種引物設(shè)計軟件，如產(chǎn)物的長度和特異性。目前有多種引物設(shè)計軟件，如primer premier5、Oligo和北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授開發(fā)的和北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院李伍舉教授開發(fā)的Biosun等，等，I

27、nternet免費引物設(shè)計網(wǎng)站有免費引物設(shè)計網(wǎng)站有primer 3，Primerfinder等。等。引物設(shè)計有以下幾個原則：引物設(shè)計有以下幾個原則：（1 1）引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進(jìn)行設(shè)計，引物與非靶序列之間不要超過）引物的特異性。引物應(yīng)根據(jù)目的序列進(jìn)行設(shè)計，引物與非靶序列之間不要超過 7070的同源性或連續(xù)的同源性或連續(xù)8 8個的堿基互補(bǔ)，減少非特異產(chǎn)物；個的堿基互補(bǔ)，減少非特異產(chǎn)物；（2 2）引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補(bǔ)結(jié)合的部分，不包括在）引物的長度。一般指引物中能與模板序列互補(bǔ)結(jié)合的部分，不包括在55端額外端額外增加的酶切位點序列和其他序列。引物長度以增加的酶切位

28、點序列和其他序列。引物長度以181824 bp24 bp為佳。為佳。（3）引物）引物3末端的堿基。引物末端的堿基。引物3末端是延伸的始端，堿基錯配會影響延伸效率。當(dāng)最后一個末端是延伸的始端，堿基錯配會影響延伸效率。當(dāng)最后一個堿基是堿基是A時，容易發(fā)生錯配，所以引物時，容易發(fā)生錯配，所以引物3末端最好不要為末端最好不要為A；（4）引物的）引物的G+C含量一般為含量一般為4060，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)；，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)；（5）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些都）兩條引物不能形成穩(wěn)定的二聚體，或引物自身不能形成穩(wěn)定的二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這些都會影響

29、引物與模板的結(jié)合。會影響引物與模板的結(jié)合。（6）兩條引物的融解溫度）兩條引物的融解溫度Tm值盡量不要相差太大，引物的值盡量不要相差太大，引物的Tm值粗略計算公式為值粗略計算公式為Tm = 4 （G+C）+2（A+T）；）；（7）引物的）引物的5端對擴(kuò)增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，引物端對擴(kuò)增特異性沒有影響，因此可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，引物5端端修飾包括加酶切位點、標(biāo)記生物素和熒光等，引物修飾包括加酶切位點、標(biāo)記生物素和熒光等，引物3端是延伸的開始，不能進(jìn)行任何修端是延伸的開始，不能進(jìn)行任何修飾。飾。引物設(shè)計軟件引物設(shè)計軟件primer premier 5.0的使

30、用的使用可通過兩個方法將序列輸入軟件中可通過兩個方法將序列輸入軟件中在表中粘貼序列在表中粘貼序列打開原有的序列文件打開原有的序列文件選擇序列文選擇序列文件所在位置件所在位置 在對話框中輸入待擴(kuò)增序列在對話框中輸入待擴(kuò)增序列 點擊左上角的點擊左上角的“Primer”按鈕按鈕Hairpin: 引物自身是否會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物自身是否會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)Dimer: 同一種引物是否會形成二聚體同一種引物是否會形成二聚體False primiring: 引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對引物在待擴(kuò)增序列中其他位置是否有配對Cross Dimer: 正向與反向引物間是否會形成二聚體正向與反向引物間是否會形成二

31、聚體引物設(shè)計界面引物設(shè)計界面正向和正向和反向引反向引物的互物的互換換正向和反向正向和反向引物的評價引物的評價正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每點擊左每點擊左邊紅色的邊紅色的按鈕，就按鈕，就出現(xiàn)相應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)的內(nèi)容的內(nèi)容對正向和反向引物進(jìn)行編輯對正向和反向引物進(jìn)行編輯可對引物進(jìn)行增加或減少堿基可對引物進(jìn)行增加或減少堿基用鍵盤輸入了用鍵盤輸入了5 5個堿基個堿基引物的信息引物的信息改動后引物的信息改動后引物的信息重新回到雙引物的界面重新回到雙引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3輸出引物序列輸出引物序

32、列了解并掌握了解并掌握PCR基因擴(kuò)增的基本原理基因擴(kuò)增的基本原理熟悉熟悉PCR基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程 實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康牡谌糠?，第三部分，PCR實驗操作實驗操作一、概述一、概述 PCR：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用DNA合成合成 酶和四種脫氧核糖酶和四種脫氧核糖核酸進(jìn)行核酸進(jìn)行DNA的體外合成反應(yīng)。的體外合成反應(yīng)。 PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點，能夠在幾個小時內(nèi)獲技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點，能夠在幾個小時內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。得多達(dá)幾百萬

33、拷貝的目的基因。 該技術(shù)在上個世紀(jì)該技術(shù)在上個世紀(jì)80年代中期由美國年代中期由美國K.Mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，K.Mullis也因此獲得也因此獲得1993年度的諾貝爾化學(xué)獎。年度的諾貝爾化學(xué)獎。二、二、PCR基本原理基本原理 DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是 DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、引發(fā)酶、連接酶、引發(fā)酶、RNA引物、四種脫氧核糖核酸、引物、四種脫氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、

34、離子環(huán)境等超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。多成份參與的過程。 PCR是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制，所以在一個復(fù)制，所以在一個PCR中中必需成分是必需成分是 1. 模板模板DNA 2. DNA聚合酶聚合酶 3. 四種脫氧核糖核酸四種脫氧核糖核酸 4. 正向和反向兩條引物正向和反向兩條引物 5. 適當(dāng)?shù)木彌_體系。適當(dāng)?shù)木彌_體系。模板序列：待擴(kuò)增的模板序列：待擴(kuò)增的DNA序列，一般為雙鏈的序列，一般為雙鏈的DNA可包括線形雙螺旋可包括線形雙螺旋DNA，如基，如基因組因組DNA，及閉環(huán)雙鏈，及閉環(huán)雙鏈DNA，如質(zhì)粒；，如質(zhì)粒；模板的來

35、源很廣，如從細(xì)胞模板的來源很廣，如從細(xì)胞/細(xì)菌中提取基因組細(xì)菌中提取基因組DNA、提取、提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA、質(zhì)粒、病毒等；、質(zhì)粒、病毒等；每個反應(yīng)中模板的量為每個反應(yīng)中模板的量為1 ng1 g。質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA和純化的和純化的DNA的量可少一些，而基因的量可少一些，而基因組組DNA的量應(yīng)多一些。的量應(yīng)多一些。PCR靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致PCR的非特異性擴(kuò)增。的非特異性擴(kuò)增。1、模板、模板DNA引物（引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的）也稱為寡核苷酸引物

36、，常規(guī)的PCR反應(yīng)需要兩種引物，分別成為反應(yīng)需要兩種引物，分別成為5端引端引物和物和3端引物，或稱為正向引物和反向引物。端引物，或稱為正向引物和反向引物。通常通常DNA及及mRNA序列的寫法為序列的寫法為53，所以，所以5端引物與目的序列的端引物與目的序列的5末端序列相同，而末端序列相同，而3端引物與目的序列的端引物與目的序列的3末端序列反向互補(bǔ)。末端序列反向互補(bǔ)。2 2、引物、引物它們作為它們作為DNADNA擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增DNADNA序列的長度。序列的長度。為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與

37、模板相匹配部分應(yīng)至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的DNA的一種酶。的一種酶。早期的早期的PCR反應(yīng)使用的反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大腸桿菌聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但該酶在高溫片段。但該酶在高溫下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時候再加入一份酶。下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時候再加入一份酶。隨著新的耐熱隨著新的耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在PCR反應(yīng)中的應(yīng)

38、用，使反應(yīng)中的應(yīng)用，使PCR操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶最適工作溫度為聚合酶最適工作溫度為75-80。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性，在鎂離子存在情況聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿下可催化核苷酸沿53方向發(fā)生聚合反應(yīng)。方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、DNA聚合酶聚合酶4 4、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP，為，為PCR反應(yīng)中反應(yīng)中DNA合成原料。合成原料。在新的一個反應(yīng)

39、體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種在新的一個反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。緩沖液提供緩沖液提供PCR反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有KCl、Tris-Cl和和MgCl2。其中其中Mg2的濃度最重要，它能影響的濃度最重要，它能影響DNA聚合酶的活性，以及模板與聚合酶的活性，以及模板與PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的解鏈溫度。解鏈溫度。5 5、緩沖液、緩沖液變性：是指模板的熱變性，雙螺旋

40、模版變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版DNA成為單鏈的成為單鏈的DNA分子；在應(yīng)用分子；在應(yīng)用Taq DNA聚聚合酶進(jìn)行合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時，變性往往在反應(yīng)時，變性往往在9495條件下進(jìn)行。這也是條件下進(jìn)行。這也是Taq DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行30個左右的個左右的PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低的熔解溫度低510，PCR實驗要對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。實驗要對退火溫

41、度進(jìn)行優(yōu)化。二、二、PCR基本步驟基本步驟延伸：在鎂離子存在條件下，延伸：在鎂離子存在條件下，DNA聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成與模版方向生成與模版DNA互補(bǔ)的新互補(bǔ)的新DNA鏈。鏈。雙鏈模版雙鏈模版DNADNA變性變性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循環(huán)多次循環(huán)（2 2n n 拷貝）拷貝）下面為一個典型的下面為一個典型

42、的PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：備注：* 比兩條引物的比兩條引物的Tm值值低低510。94 5 min 94 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-3525-35個循環(huán)個循環(huán)三、影響三、影響PCR因素因素 雖然雖然PCRPCR操作很方便，但影響因素也很多，從而影響操作很方便，但影響因素也很多，從而影響PCRPCR的特異性和高效性。的特異性和高效性。引物引物變性溫度和時間變性溫度和時間退火溫度和時間退火溫度和時間延伸溫度和時間延伸溫度和時間1.1. 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)引物決定了引物決定了PCR產(chǎn)物的長度和特異性。產(chǎn)物的長度和特異性。引物的設(shè)計要求請看本

43、實驗講義引物的設(shè)計要求請看本實驗講義“引物設(shè)計引物設(shè)計”部分。部分。1 1、引物、引物在在PCR反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈DNA完全變性成單鏈完全變性成單鏈DNA，一般設(shè)為，一般設(shè)為95、5 min；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為95、30s。有些模板有些模板DNA的的G+C含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響會影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2 2、變性溫度和時間、變性溫度和時間退火溫度與引物的退火溫度與引物的Tm值相關(guān)，一般比值相關(guān)，一般比Tm

44、值低值低510。退火溫度設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合退火溫度設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低而降低PCR效率。效率。在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間設(shè)置為設(shè)置為30s基本上就足夠了?；旧暇妥銐蛄?。3 3、退火溫度和時間、退火溫度和時間所用所用DNA聚合酶的

45、最佳活性溫度決定了延伸溫度，如聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如Taq聚合酶的最佳溫度為聚合酶的最佳溫度為7080度，所以延伸溫度設(shè)為度，所以延伸溫度設(shè)為72即可。即可。在實踐中在實踐中Taq DNA聚合酶的延伸效率約為聚合酶的延伸效率約為500 bp/30 s，若待擴(kuò)增的片段較長，可適，若待擴(kuò)增的片段較長，可適當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴(kuò)增。當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴(kuò)增。4 4、延伸溫度和時間、延伸溫度和時間在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，PCR產(chǎn)產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，

46、此時稱為平臺效應(yīng)。物不再呈指數(shù)增加，此時稱為平臺效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為循環(huán)次數(shù)設(shè)為2530次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實驗要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。致堿基錯配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。5 5、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù)DNA模板：以模板：以pPIC9-NGAL為模板，來擴(kuò)增不包含信號肽序列的為模板，來擴(kuò)增不包含信號肽序列的NGAL編碼區(qū)編碼區(qū)引物：引物： PCR上游引物（上游引物（P1）：）：5-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3 PCR下游引物（下游引物（P2）：）：5-CGGAAT

47、TCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3 底下有橫線的堿基為酶切位點：底下有橫線的堿基為酶切位點：XholI (P1)，EcoRI(P2)2Taq PCR Master Mix （廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品成份為：（廣州佰路生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品成份為： 0.1 U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 4 mM MgCl2 無菌水無菌水100bp plus ladder DNA marker本實驗所用試劑本實驗所用試劑實驗操作實驗操作95 2min95 2min9

48、4 30s94 30s60 30s 60 30s 72 30s72 30s72 5min72 5min30個循環(huán)個循環(huán)按以下次序?qū)⒏鞒煞旨影匆韵麓涡驅(qū)⒏鞒煞旨覲CR管中。管中。 2Taq PCR MasterMix 5 l P1 (12.5 M ) 1 l P2 (12.5 M) 1 l 無菌水無菌水 2 l pPIC9-NGAL 1 l 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：10 l混勻，稍加離心并標(biāo)記?；靹?，稍加離心并標(biāo)記。PCR反應(yīng)于反應(yīng)于ABI 2720 Thermer cycler進(jìn)行，進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 凝膠準(zhǔn)備凝膠準(zhǔn)備 稱稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 1TAE； 微波爐加熱大約微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；分鐘，熔化瓊脂糖； 熔化的瓊脂糖自然冷卻到熔化的瓊脂糖自然冷卻到607