等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及性能評價

1、www.CRTER.org玄光善，等. 等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及性能評價等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及性能評價玄光善1，穆蘭蘭1，孫 桐1，李 青2 (1青島科技大學(xué)藥學(xué)系，山東省青島市 266000；2青島中皓生物工程有限公司，山東省青島市 266000)引用本文：玄光善，穆蘭蘭，孫桐，李青. 等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及性能評價J.中國組織工程研究，2016，20(43):6451-6457.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.010 ORCID: 0000-0001-7674

2、-6405(玄光善)文章快速閱讀：等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料的制備及性能評價玄光善，男，1964年生，吉林省延吉市人，朝鮮族，2001年慶北大學(xué)畢業(yè)，博士，教授，主要從事藥物分析及醫(yī)藥用生物材料研究。中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2016)43-06451-07稿件接受：2016-08-04采用紅外光譜對表征其結(jié)構(gòu)，掃描電子顯微鏡觀察纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)，并考察其親水性、機(jī)械性能，通過MTT法考察材料的細(xì)胞毒性，并觀察細(xì)胞生長狀況等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料具有良好的纖維形貌、親水性及機(jī)械性能，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖，無細(xì)胞毒性進(jìn)行C

3、O2、NH3等離子體處理，最后通過交聯(lián)劑交聯(lián)，與膠原蛋白及硫酸軟骨素復(fù)合，制備等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料 通過靜電紡絲方法制備聚氨酯支架材料文題釋義：聚氨酯材料：是具有微相分離結(jié)構(gòu)的彈性聚合物，具有優(yōu)異的機(jī)械性能、良好的生物相容性(包括血液相容性)，分子設(shè)計自由度大，改變其結(jié)構(gòu)中軟硬段的組成及配比，可得到不同硬度、機(jī)械性能的產(chǎn)物，所以被認(rèn)為是最佳綜合性能的生物醫(yī)學(xué)合成材料，并且被廣泛用于人工心臟、人工皮膚、藥物載體、人工血管等領(lǐng)域。硫酸軟骨素：在傷口愈合中起到重要作用，它可保持纖維和細(xì)胞間水分，促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移和營養(yǎng)成分遷移，且降解產(chǎn)物無毒，可為細(xì)胞提供碳源和氮源，增加細(xì)胞的

4、信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成，促進(jìn)細(xì)胞代謝，加速傷口愈合。故將其用在皮膚支架材料上，可顯著提高材料生物性能。摘要背景：聚氨酯具有優(yōu)異的機(jī)械性能和良好的生物相容性，但其疏水性不利于細(xì)胞黏附生長，故限制了聚氨酯在皮膚支架上的應(yīng)用。目的：對聚氨酯支架材料進(jìn)行改性，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，檢測其親水性、機(jī)械性能及細(xì)胞毒性。方法：通過靜電紡絲方法制備聚氨酯支架材料，然后進(jìn)行CO2、NH3等離子體處理，最后通過交聯(lián)劑交聯(lián)，與膠原蛋白及硫酸軟骨素復(fù)合，制備等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料，設(shè)置為A組；設(shè)置3組對照，聚氨酯經(jīng)靜電紡絲后進(jìn)行等離子體處理制備成支架材料后，浸泡在未加交聯(lián)劑的膠原硫酸軟骨

5、素混合溶液中，取出風(fēng)干，設(shè)為B組；聚氨酯經(jīng)靜電紡絲后進(jìn)行等離子體處理，制備成支架材料，設(shè)為C組；將聚氨酯進(jìn)行靜電紡絲，制備成支架材料，設(shè)為D組。對比4組材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)、親水性、機(jī)械性能及體外細(xì)胞毒性。結(jié)果與結(jié)論：等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料具有良好的纖維形貌、親水性及機(jī)械性能，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖，無細(xì)胞毒性。關(guān)鍵詞：生物材料；材料相容性；等離子體；聚氨酯；膠原；硫酸軟骨素；復(fù)合材料；細(xì)胞毒性；生物相容性 主題詞：膠原；軟骨素硫酸鹽類；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083A plasma-modified polyuret

6、hane-collagen-chondroitin sulfate composite material: preparation and performanceXuan Guang-shan1, Mu Lan-lan1, Sun Tong1, Li Qing2 (1Department of Pharmacy, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 2Qingdao ChungHao Tissue Engineering Company, Qingdao

7、266000, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: Polyurethane has excellent mechanical properties and perfect biocompatibility. But its hydrophobicity is not conductive to the adhesion and growth of cells, which limits its use as the scaffold of the skin.OBJECTIVE: To modify a polyurethane scaff

8、old by plasma processing and crosslinking then to test its hydrophilic, mechanical properties and cytotoxicity in vitro.METHODS: Polyurethane porous materials were prepared into membranous materials by eletrospinning method and modified by CO2 and NH3 plasma. Then the plasma-modified polyurethane-co

9、llagen- chondroitin sulfate composite materials were prepared by crosslinking with collagen type I and chondroitin sulfate at the same time, which was named Group A. Polyurethane porous materials which were electrospun and modified by plasma were soaked into a mixed solution of collagen and chondroi

10、tin sulfate without crosslinking agent. After being air-dryed, the materials were prepared, named Group B. Polyurethane porous materials which were electrospun and modified by plasma were named Group C. Electrospun polyurethane porous materials without other treatments were named Group D. Then the m

11、orphology, hydrophilicity, mechanical property and in vitro cytotoxicity of the four groups were compared.RESULTS AND CONCLUSION: The plasma-modified polyurethane-collagen-chondroitin sulfate composite materials enjoy excellent fiber morphology, hydrophilicity and mechanical properties. It can also

12、promote cell adhesion, proliferation and have no cytotoxicity.Subject headings: Collagen; Chondroitin Sulfates; Tissue EngineeringCite this article: Xuan GS, Mu LL, Sun T, Li Q. A plasma-modified polyurethane-collagen-chondroitin sulfate composite material: preparation and performance. Zhongguo Zuzh

13、i Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6451-6457.Xuan Guang-shan, Doctor, Professor, Department of Pharmacy, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266000, Shandong Province, China6455ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction皮膚作為人體最大器官，起著保持體液、保護(hù)身體組織器官、參與免疫、抵御外界侵襲等重要作用1。當(dāng)皮膚受到

14、損傷時，這道保護(hù)屏障就會被打破，造成機(jī)體代謝紊亂、免疫失調(diào)，病原微生物借機(jī)侵入，引起一系列嚴(yán)重反應(yīng)。因此當(dāng)皮膚受到損傷時必須有適合的人工皮膚對受傷部位進(jìn)行覆蓋。目前市面上有多種敷料和組織工程皮膚，但大多數(shù)產(chǎn)品都存在機(jī)械性能差、降解速度過快、血管化速度慢和應(yīng)用時不易操作等缺點(diǎn)2。理想的皮膚組織工程支架材料應(yīng)具備一定的柔韌性及機(jī)械強(qiáng)度，與組織生長相適應(yīng)的降解能力，良好的生物相容性，可使細(xì)胞黏附生長，促進(jìn)皮膚組織快速愈合。將天然生物材料與合成支架進(jìn)行復(fù)合是制備理想支架材料的方法，已成為目前生物材料研究的熱點(diǎn)，近年來提出的復(fù)合材料有聚乳酸-羥基乙酸共聚物-膠原3-5、聚乙烯醇-殼聚糖6-7、聚己內(nèi)酯-

15、殼聚糖等8-10。聚氨酯材料是具有微相分離結(jié)構(gòu)的彈性聚合物11，具有優(yōu)異的機(jī)械性能、良好的生物相容性(包括血液相容性)，分子設(shè)計自由度大，改變其結(jié)構(gòu)中軟硬段的組成及配比，可得到不同硬度、機(jī)械性能的產(chǎn)物12，所以被認(rèn)為是最佳綜合性能的生物醫(yī)學(xué)合成材料，并且被廣泛用于人工心臟、人工皮膚、藥物載體、人工血管等領(lǐng)域13。聚碳酸酯型聚氨酯的軟段由聚碳酸酯二醇構(gòu)成14，由于碳酸酯鍵能在生理環(huán)境中獲得更好穩(wěn)定性，使其與其他聚氨酯相比有更好的生物穩(wěn)定性和生物相容性15-16。但聚氨酯材料本身具有疏水性，細(xì)胞不易黏附和生長，這一因素也限制了其作為細(xì)胞支架材料的應(yīng)用17。膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最多、分布最為廣泛的

16、一類細(xì)胞外蛋白質(zhì)。作為一種天然生物材料，膠原蛋白具有來源廣、免疫原性低、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)18。皮膚愈合是由真皮層細(xì)胞合成分泌膠原蛋白開始的，因此，在聚氨酯支架中復(fù)合膠原蛋白，不僅可以提高材料的生物相容性，其降解產(chǎn)物氨基酸也可為真皮細(xì)胞合成膠原提供原料，促進(jìn)皮膚愈合19-20。硫酸軟骨素在傷口愈合中起到重要作用，它可保持纖維和細(xì)胞間水分，促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移和營養(yǎng)成分遷移，且降解產(chǎn)物無毒，可為細(xì)胞提供碳源和氮源，增加細(xì)胞的信使核糖核酸和脫氧核糖核酸的生物合成，促進(jìn)細(xì)胞代謝，加速傷口愈合21。故將其用在皮膚支架材料上，可顯著提高材料生物性能。實(shí)驗(yàn)擬通過靜電紡絲的方式將聚氨酯制備成纖維膜狀支架材料，進(jìn)

17、行CO2、NH3等離子體處理，接枝-COOH、-NH2，通過交聯(lián)劑交聯(lián)使其與膠原蛋白及硫酸軟骨素復(fù)合，制備等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料，采用紅外光譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，掃描電子顯微鏡觀察纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)，并考察其親水性、機(jī)械性能，通過MTT法考察材料的細(xì)胞毒性，并觀察細(xì)胞生長狀況。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 相互對照，觀察性實(shí)驗(yàn)。1.2 時間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年5至12月在青島科技大學(xué)和青島中皓生物工程有限公司完成。1.3 材料 PC-3575A聚碳酸酯型聚氨酯購自Lubrizol；型膠原蛋白(相對分子質(zhì)量300 000，純度>

18、99%)實(shí)驗(yàn)室自提；NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株購自上海研晶生物科技有限公司；Dil染液購自Amresco公司；硫酸軟骨素、噻唑藍(lán)(MTT)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)自sigma公司；靜電紡絲機(jī)(實(shí)驗(yàn)室自組裝)；DT-02S低溫等離子體處理儀(蘇州奧普斯等離子體科技有限公司)；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；CKX41型反射熒光顯微鏡(日本OLYMPUS )；IC1000 countstar細(xì)胞計數(shù)儀(Inno- Alliance Biotech)；Zwick-Ro

19、ell Z005拉力機(jī)(德國Zwick-Roell公司)；Multiskan FC酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Fisher Scientific公司)；JSM-7500F掃描電鏡(日本電子株式會社)。1.4 實(shí)驗(yàn)方法 等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素支架的制備：將聚氨酯60 烘干至恒質(zhì)量，溶于N，N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃摩爾比為21的混合溶劑中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的混合溶液，靜置除盡氣泡后進(jìn)行靜電紡絲。靜電紡絲接收距離15 cm，電壓17 kV，流速 1.5 mL/h，濕度50%。放置24 h后取下纖維膜，放置于真空干燥箱干燥3 d。將靜電紡絲膜懸掛放入等離子體處理儀，抽真空至真空

20、度達(dá)到15 Pa左右時，通入CO2，控制鋼瓶出氣閥壓力2 MPa，減壓閥壓力0.2 MPa，最終腔體氣壓為60 Pa，待氣壓穩(wěn)定后，開始進(jìn)行輝光放電并計時，處理時間各5 min，處理功率為100 W，相同方法進(jìn)行NH3處理。將含10.0 g/L膠原蛋白的0.05 mol/L醋酸溶液，用pH=6.9的0.1 mol/L MES緩沖溶液稀釋至 4 g/L。取5 mL稀釋后的膠原溶液，加入11.5 mg NHS、5 mg硫酸軟骨素，攪拌30 min；再加入5 mL濃度為 40 mmol/L EDC乙醇溶液，混勻，4 孵育5 min后，加入等離子體處理過的靜電紡絲膜，室溫下反應(yīng)8 h。反應(yīng)完畢，用0.

21、05 mol/L醋酸溶液沖洗未交聯(lián)的膠原及硫酸軟骨素，并用大量的去離子水沖洗干凈，置于35 真空烘箱中干燥至恒質(zhì)量。將干燥的支架材料用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇清洗4次，30 min/次，用超純水清洗4次，15 min/次，風(fēng)干，設(shè)為A組。對照品的制備：將聚氨酯進(jìn)行靜電紡絲，經(jīng)等離子體處理后，制備成支架材料，浸泡在未加交聯(lián)劑的膠原硫酸軟骨素混合溶液中，取出風(fēng)干，設(shè)為B組；將聚氨酯進(jìn)行靜電紡絲，經(jīng)等離子體處理后，制備成支架材料，風(fēng)干，設(shè)為C組；將聚氨酯進(jìn)行靜電紡絲，制備成支架材料，風(fēng)干，設(shè)為D組。1.5 主要觀察指標(biāo)紅外光譜檢測：全反射法測4種材料的紅外吸收光譜，對材料表面進(jìn)行表征。 掃描電鏡觀察：將4

22、種支架材料表面噴金，3 kV加速電壓下，用掃描電鏡觀察纖維表面形貌并拍照。 親疏水性觀察：等離子體處理和偶聯(lián)膠原蛋白及硫酸軟骨素都會導(dǎo)致支架材料表面親水性的差異，實(shí)驗(yàn)對4種支架材料的親水性進(jìn)行了評價，采用接觸角儀對支架材料表面的接觸角進(jìn)行測定。 機(jī)械性能評價：取30 mm×30 mm濾紙，兩端各貼上雙面膠，將它貼在4種支架材料上，表面再貼兩層濾紙，材料與濾紙成夾心狀，將濾紙片剪成3份，每份為30 mm×1 0mm樣品條，去掉中間未粘濾紙，測支架材料厚度及寬度，夾持兩端濾紙，用拉力機(jī)對其力學(xué)性能進(jìn)行測試。拉伸速度10 mm/min，所得結(jié)果取平均值。 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：材料浸

23、提液的制備：將4種支架材料用電子束輻照，輻照劑量14 kGy。無菌條件將各樣品剪碎移至6孔板，每孔6 cm2/mL(表面積/體積)，加含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液， 37 恒溫培養(yǎng)24 h，收集備用。取NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，按5×107 L-1細(xì)胞濃度接種于96孔板(每孔 100 L)，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，37 培養(yǎng) 24 h。吸棄孔內(nèi)廢液，實(shí)驗(yàn)組每孔加100 L材料浸提液(A-D組材料)，對照組加100 L含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，空白組加100 L不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，顯微鏡觀察

24、細(xì)胞形態(tài)并拍照，加MTT工作液20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄內(nèi)液，加二甲亞砜靜置。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，吸收波長490 nm，重復(fù)4次，結(jié)果取平均值，計算細(xì)胞相對增殖度(RGR)。當(dāng)細(xì)胞相對增殖度在100%級以上時為0級毒性；在80%-99%時為1級毒性；在50%-79%時為2級毒性；在30%-49%時為3級毒性；在0-29%時為1級毒性。細(xì)胞毒性均為0級和1級，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對于醫(yī)療器械的生物學(xué)要求。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行t 檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 紅外光譜分析結(jié)果 圖1為4種支架材料的紅外光譜圖

25、，其中位于3 303 cm-1特征吸收峰為N-H伸縮振動峰，位于2 930 cm-1和2 850 cm-1的特征吸收峰分別為亞甲基中C-H的對稱和不對稱伸縮振動吸收峰，位于 1 715 cm-1的特征峰為聚氨酯軟段聚碳酸酯二醇的C=O伸縮振動峰，O=C-O的面外彎曲特征峰位于圖中 790 cm-1。C組在CO2和NH3等離子體處理后，位于 2 850 cm-1的特征吸收峰明顯變小，而位于3 303 cm-1特征吸收峰明顯增寬增大，為伯胺伸縮振動特征峰，說明經(jīng)氨氣等離子體處理后聚氨酯表面接枝大量-NH2；位于3 600-3 200 cm-1的-OH特征峰出現(xiàn)，并且C=O伸縮振動峰及O=C-O的面

26、外彎曲特征峰明顯增大，表明CO2在激發(fā)轉(zhuǎn)為等離子態(tài)后，接枝在聚氨酯的上形成羧基； 1 250 cm-1處出現(xiàn)C-O-C的不對稱伸縮振動強(qiáng)峰，表示活化的CO2在聚氨酯表面形成酯基。表面涂布膠原及硫酸軟骨素時，聚氨酯表面其他特征峰被掩蓋，且由于膠原和硫酸軟骨素含有大量-OH，紅外光譜出現(xiàn)3 600- 3 200 cm-1較寬的峰。A組經(jīng)EDC和NHS交聯(lián)，-NH2和-COOH反應(yīng)生成仲酰胺鍵(RCONHR')。較等離子體處理聚氨酯材料及表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯材料，等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料紅外光譜圖中1 680 cm-1處出現(xiàn)仲酰胺C=O伸縮振動的強(qiáng)

27、吸收峰，即酰胺帶；1 530 cm-1處和1 305 cm-1處分別出現(xiàn)由于N-H變形振動和C-N伸縮振動偶合產(chǎn)生的酰胺帶和酰胺帶，表明存在仲酰胺鍵，可能是交聯(lián)生成的新的仲酰胺鍵。2.2 掃描電鏡觀察支架材料表面形貌 由圖2掃描電鏡照片可見，該靜電紡絲條件制備的聚氨酯支架形貌良好，纖維平滑直徑分布均勻，平均直徑為1 m左右，纖維較粗，這是由于與電壓、溶液的流速、距離相比，溶劑是影響靜電紡絲形貌的一個比較重要因素。實(shí)驗(yàn)選用的是N，N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃摩爾比為21的混合溶劑，四氫呋喃的表面張力低且易揮發(fā)，使射流纖維外層快速揮發(fā)，限制了纖維的進(jìn)一步拉伸，使纖維直徑較粗；N，N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)

28、高，不易揮發(fā)，可使纖維在電場中有效拉伸。因此，適當(dāng)增加N，N-二甲基甲酰胺比例，可一定程度減小纖維直徑，但當(dāng)N，N-二甲基甲酰胺量過多時，由于溶劑揮發(fā)過慢易形成連珠。等離子體處理聚氨酯表面稍有毛糙，這是由于等離子體處理對聚氨酯纖維有一定的刻蝕作用，但整體表觀影響不大。等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料纖維表面被膠原包裹填充，經(jīng)化學(xué)交聯(lián)復(fù)合材料整體出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，纖維有彎曲收縮現(xiàn)象；未經(jīng)等離子體處理聚氨酯支架材料表面物理涂布膠原硫酸軟骨素涂層，纖維直徑稍有變粗。 2.3 親水性檢測結(jié)果 生物材料的親疏水性是限制其應(yīng)用的主要因素。就皮膚支架而言，適宜親水性的皮膚修復(fù)材料可使傷口保持濕潤，有

29、利于細(xì)胞黏附生長，促進(jìn)傷口愈合。對各種支架材料接觸角進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料接觸角為110°，材料不發(fā)生浸潤；經(jīng)等離子體處理后，材料的親水性顯著增加，水滴滴至材料后被迅速吸收，無法測出接觸角，涂布和接枝膠原硫酸軟骨素的材料也迅速將水滴吸收。聚氨酯有大量非極性基團(tuán)如酯基，有較高的疏水性，離子體處理可在表面接枝親水基團(tuán)，雖然等離子體只在接觸面反應(yīng)，但由于靜電紡絲纖維之間空隙大，材料比表面積大，增加了處理效率，使親水性顯著增加；膠原蛋白中含有大量-NH2、-OH，硫酸軟骨素含有-OH、-COOH、-SO3H親水基團(tuán)，也有很好的親水性。故將聚氨酯進(jìn)行等離子體處理并與膠原

30、蛋白及硫酸軟骨素偶聯(lián)處理，可得親水性良好的支架材料。2.4 機(jī)械性能測試結(jié)果 復(fù)合材料的應(yīng)用是需要良好的機(jī)械性能。4種支架材料的應(yīng)力-應(yīng)變曲線見圖3，等離子體處理前后聚氨酯支架都呈明顯的黏彈性力學(xué)性質(zhì)，初始模量小，斷裂伸長率達(dá)550%左右，拉伸強(qiáng)度可至30 MPa，4種支架材料機(jī)械性沒有明顯差異。這是由于等離子體只在材料表面接枝，對材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)無影響，不破壞材料整體的機(jī)械性能，表面接枝的膠原蛋白及硫酸軟骨素后支架材料的機(jī)械強(qiáng)度也沒有明顯變化。2.5 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由于聚氨酯是用N，N-二甲基甲酰胺和四氫呋喃溶解后進(jìn)行靜電紡絲，并與膠原蛋白及硫酸軟骨素進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，各支架材料雖經(jīng)乙醇梯度

31、清洗，仍可能有微量殘留，對細(xì)胞有一定的毒性。由圖4可見A組等離子體處理聚氨酯經(jīng)膠原和硫酸軟骨素修飾后細(xì)胞生長狀況良好，數(shù)量較多，偶見圓形細(xì)胞。B組細(xì)胞生長情況與A組相似，但細(xì)胞數(shù)量較A組稍多，可能由于表面涂布膠原及硫酸軟骨素為細(xì)胞生長提供了營養(yǎng)物質(zhì)；C組細(xì)胞有輕微的拉絲現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量較前2組較少；D組死細(xì)胞數(shù)相對較多，有較嚴(yán)重的拉絲現(xiàn)象。A-D組的細(xì)胞相對增殖率分別為105.5%、106.6%、98%、91.8%，4種材料細(xì)胞相對增殖率均大于90%，即4種材料的細(xì)胞毒性為0-1級，符合國家標(biāo)準(zhǔn)對于醫(yī)療504030201000 100 200 300 400 500 600應(yīng)變(%)應(yīng)力(MPa

32、)3 000 2 000 1 000波數(shù)(cm-1)圖3 不同支架材料應(yīng)力-應(yīng)變曲線Figure 3 The stress-strain curves of different scaffolds圖注：圖中A為等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料；B為表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯支架料；C為經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料；D為未經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料。4種支架材料機(jī)械性沒有明顯差異。圖1 不同支架材料的紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectrograms of different scaffolds圖注：圖中A為等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟

33、骨素復(fù)合材料；B為表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯支架料；C為經(jīng)等離子體處理聚氨酯支架材料；D為未經(jīng)等離子體處理聚氨酯支架材料。圖2 不同支架材料的掃描電鏡觀察結(jié)果(×5 000)Figure 2 Scanning electron microscope observation of different scaffolds (×5 000)圖注：圖中A為等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料；B為表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯支架料；C為經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料；D為未經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料。等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素

34、復(fù)合材料纖維有彎曲收縮現(xiàn)象；未經(jīng)等離子體處理聚氨酯支架材料表面物理涂布膠原硫酸軟骨素涂層，纖維直徑稍有變粗。圖4 不同支架表面的NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞形態(tài)觀察(×150)Figure 4 Morphological observation of embryonic fibroblasts from NIH3T3 mice on different scaffolds (×150)圖注：圖中A為等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料，細(xì)胞生長狀況良好，數(shù)量較多，偶見圓形細(xì)胞；B為表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯支架料，細(xì)胞生長情況與圖A相似，但細(xì)胞數(shù)

35、量稍多；C為經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料，細(xì)胞有輕微的拉絲現(xiàn)象，細(xì)胞數(shù)量較前2組較少；D為未經(jīng)等離子體處理的聚氨酯支架材料，死細(xì)胞數(shù)相對較多，有較嚴(yán)重的拉絲現(xiàn)象。器械的生物學(xué)要求22-23。3 討論 Discussion將聚氨酯同時進(jìn)行CO2和NH3等離子體處理，再與膠原蛋白及硫酸軟骨素偶聯(lián)的研究鮮有報道。實(shí)驗(yàn)通過靜電紡絲方式制備將聚氨酯成膜狀支架材料，等離體子處理后與型膠原蛋白及硫酸軟骨素交聯(lián)，制備等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料，以表面涂布膠原及硫酸軟骨素的等離子體處理聚氨酯支架材料、等離子體處理聚氨酯支架材料及未經(jīng)等離子體處理聚氨酯支架材料為對照，采用紅外光譜和掃描電子顯微

36、鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，并檢測其親水性、機(jī)械性能，通過MTT法檢測材料的細(xì)胞毒性，并觀察生長狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料性能優(yōu)異，是理想的皮膚支架材料，具有較大的研究開發(fā)價值。等離子體是氣體在近真空狀態(tài)，在電場能激發(fā)下轉(zhuǎn)變成不同于固體液體氣體的物質(zhì)第四態(tài)，其中包含中性和激發(fā)態(tài)的原子或分子、電子、離子及各類自由基等離子。它有更強(qiáng)的活性，更易于與接觸面發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)條件容易掌控，反應(yīng)溫度接近常溫，不會對材料造成熱解或燒灼25。利用不同等離子體處理如O2、NH3、CO2、N2等，可在材料上接枝不同的活潑基團(tuán)如-OH、-NH2、-COOH等26，使材料親水性發(fā)生變化更利

37、于細(xì)胞的黏附生長27-28。實(shí)驗(yàn)中，將聚氨酯進(jìn)行靜電紡絲，顯著增加了比表面積，等離子體處理后在其表面形成大量活潑的-COOH和-NH2。由于EDC/NHS交聯(lián)體系中-COOH和-NH2反應(yīng)生成酰胺鍵，等離子體處理為聚氨酯提供了大量的-COOH和-NH2，促進(jìn)了其和膠原蛋白及硫酸軟骨素的反應(yīng)。 將聚氨酯和膠原蛋白及硫酸軟骨素進(jìn)行偶聯(lián)，制備成復(fù)合支架材料，此種制備方法有以下優(yōu)點(diǎn)：其一，膠原蛋白和硫酸軟骨素均為天然生物材料，且其降解產(chǎn)物為無毒，表現(xiàn)出極好的生物相容性，將其與聚氨酯復(fù)合，可以增加其親水性和生物相容性，減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)傷口治愈合29-31；其二，膠原蛋白的降解主要是酶水解，如膠原酶32

38、，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)交聯(lián)膠原蛋白在膠原酶溶液中2周之內(nèi)可完全降解，而交聯(lián)過后其降解速率顯著降低。當(dāng)其用于燙傷、化學(xué)燒傷等嚴(yán)重皮膚損傷時，膠原蛋白的降解速率過快，會破壞支架材料結(jié)構(gòu)，殘留聚氨酯，不利于皮膚組織生長。實(shí)驗(yàn)證明，將聚氨酯多孔材料進(jìn)行NH3、CO2等離子體處理，通過靜電紡絲法制備膜狀支架材料同時與型膠原蛋白及硫酸軟骨素交聯(lián)，制備的等離子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料具有良好的纖維形貌、親水性、機(jī)械性能，能促進(jìn)細(xì)胞黏附增殖，在一定程度上彌補(bǔ)了目前皮膚敷料存在的不足，但是該復(fù)合材料在實(shí)際應(yīng)用之前，需對其生物相容性進(jìn)行進(jìn)一步研究，根據(jù)皮膚創(chuàng)傷愈合程度調(diào)節(jié)膠原蛋白及硫酸軟骨素的含

39、量，并對材料的降解情況進(jìn)行深入研究，控制材料的降解速率?？傊入x子體處理聚氨酯-膠原-硫酸軟骨素復(fù)合材料在皮膚支架材料上將有很大的應(yīng)用前景。致謝：感謝青島中皓生物工程有限公司同事的關(guān)心和幫助。作者貢獻(xiàn)：第一作者構(gòu)思設(shè)計實(shí)驗(yàn)，對文章進(jìn)行審校，第二作者實(shí)施實(shí)驗(yàn)并起草，與三、四作者共同分析文獻(xiàn)資料。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：未涉及倫理沖突內(nèi)容。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對于研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機(jī)數(shù)據(jù)

40、庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 Mansbridge J. Skin tissue engineering.J Biomat Sci Polym E.2008;19(8):955-968.2 董麗,王旭昇,馬紹英,等.組織工程皮膚的構(gòu)建及組織形態(tài)學(xué)觀察J.中國組織工程研究,2011,15(41):7631-7634.3 Cao H,Chen MM,Liu Y,et al.Fish collagen-based scaffold containing PLGA micro

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