western+blot+ppt

1、Western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù) Western blot Western blot 原理原理nWestern Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色以檢測(cè)特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強(qiáng)離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長(zhǎng)碳鏈.當(dāng) SDS

2、與蛋白質(zhì)混合時(shí),它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái),而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià),使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素M丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 MSDSM配膠的Tris緩沖液MTEMEDM過(guò)硫酸銨(時(shí)間)MTris-甘氨酸電泳緩沖液凝膠成份凝膠成份分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)凝膠濃度凝膠濃度 ，凝膠孔徑，凝膠孔徑，機(jī)械強(qiáng)度，機(jī)械強(qiáng)度 T

3、EMEDTEMED促使促使APAP形成氧自由基，進(jìn)而催形成氧自由基，進(jìn)而催化化AcrAcr單體為長(zhǎng)鏈，單體為長(zhǎng)鏈，BisBis再使長(zhǎng)鏈彼此再使長(zhǎng)鏈彼此聯(lián)成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠聯(lián)成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠（PAGPAG）。）。 AP-TEMED系統(tǒng)系統(tǒng)單體單體：丙烯酰胺（：丙烯酰胺（Acr）交聯(lián)劑交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）催化劑催化劑：過(guò)硫酸銨（：過(guò)硫酸銨（AP）誘發(fā)劑誘發(fā)劑：四甲基乙二胺（：四甲基乙二胺（TEMED）氧自由基氧自由基聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠注：注：O2為終止劑為終止劑-+上樣緩沖液（上樣緩沖液（Loading buffer）濃濃縮縮膠膠分

4、分離離膠膠Tris/HCl pH 6.8Tris/HCl pH 8.8Tris-HCl pH6.8; 甘油；甘油；SDS；巰基乙醇；溴酚藍(lán)；巰基乙醇；溴酚藍(lán) 轉(zhuǎn)膜緩沖液（轉(zhuǎn)膜緩沖液（transfer buffer） tris-HCl; glycine 電泳緩沖液（電泳緩沖液（running buffer） tris-HCl; glycine;SDS ( Acrylamide;bis; SDS; AP; TEMED)SDS-PAGE“兩膠三緩沖兩膠三緩沖”sample電泳三離子： glycine- Cl- Protien-SDS-帶負(fù)電的蛋白膠束帶負(fù)電的蛋白膠束“消除電荷差、構(gòu)像差”-+濃濃縮縮

5、膠膠分分離離膠膠pH 6.8pH 8.8SDS-PAGECl-電泳三離子： glycine- Cl- Protien-glycine-protein- HCl全部解離成全部解離成Cl-，遷移最快，走在最前，遷移最快，走在最前-“先導(dǎo)離子先導(dǎo)離子” 甘氨酸僅有甘氨酸僅有0.11%解離成解離成Gly-，遷移最慢，走在最后，遷移最慢，走在最后- “尾隨離子尾隨離子”重點(diǎn)理解：先導(dǎo)快離子后方重點(diǎn)理解：先導(dǎo)快離子后方-離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 -低電導(dǎo)區(qū)低電導(dǎo)區(qū) -電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度 ，使使glycine和和protein加速移動(dòng)。加速移動(dòng)。蛋白樣品受蛋白樣品受“夾板氣夾板氣”，被，被“壓縮壓縮”，達(dá)，達(dá)“穩(wěn)態(tài)穩(wěn)

6、態(tài)”濃濃縮縮膠膠分分離離膠膠 甘氨酸大量解離，遷移加快，走在蛋白前，跟著甘氨酸大量解離，遷移加快，走在蛋白前，跟著Cl-跑了。跑了。 樣品蛋白在均一的電場(chǎng)強(qiáng)度和樣品蛋白在均一的電場(chǎng)強(qiáng)度和PH中中“盡情盡情”泳動(dòng)泳動(dòng) 根據(jù)樣品成員的分子大小，不同的遷移率，實(shí)現(xiàn)分離根據(jù)樣品成員的分子大小，不同的遷移率，實(shí)現(xiàn)分離 （分子越小，跑得越快（分子越小，跑得越快 ）Cl-glycine-protein-小分子小分子大分子大分子中分子中分子高E低E壓縮壓縮, ,分離效應(yīng)分離效應(yīng)大致流程大致流程提取與處理樣品蛋白提取與處理樣品蛋白電泳分離樣品蛋白電泳分離樣品蛋白轉(zhuǎn)移蛋白至雜交膜轉(zhuǎn)移蛋白至雜交膜封閉非特異性位點(diǎn)封

7、閉非特異性位點(diǎn)一抗孵育一抗孵育洗滌洗滌二抗孵育二抗孵育 洗滌洗滌底物顯色或曝光檢測(cè)底物顯色或曝光檢測(cè)E鼠兔固相載體固相載體人源目的蛋白人源目的蛋白兔源二抗兔源二抗(抗鼠抗鼠Fc段段)鼠源一抗鼠源一抗HRP明確蛋白樣品的來(lái)源（組織；明確蛋白樣品的來(lái)源（組織；細(xì)胞；體液）細(xì)胞；體液）選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥绞剑ㄑ心?；選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥绞剑ㄑ心ィ怀?；剪切；凍融等）超聲；剪切；凍融等?選擇適當(dāng)?shù)牧呀膺x擇適當(dāng)?shù)牧呀鈈uffer（SDS；RIPA；NP-40；商品化試劑盒）；商品化試劑盒）加入合適的蛋白酶抑制劑加入合適的蛋白酶抑制劑（Aprotinin ；PMSF；leupeptin ; pepstantinA

8、; PIC; EDTA；EGTA）蛋白樣品提取問(wèn)題蛋白樣品提取問(wèn)題蛋白位置蛋白位置推薦推薦bufferbuffer全細(xì)胞全細(xì)胞NP-40 or RIPANP-40 or RIPA胞漿（可溶性蛋胞漿（可溶性蛋白）白）Tris-HClTris-HCl胞漿（骨架結(jié)合胞漿（骨架結(jié)合蛋白）蛋白）Tris-TritonTris-Triton膜蛋白膜蛋白NP-40 or RIPANP-40 or RIPA核蛋白核蛋白R(shí)IPA or RIPA or 核蛋白核蛋白提取試劑盒提取試劑盒線粒體蛋白線粒體蛋白R(shí)IPA or RIPA or 線粒體線粒體分離試劑盒分離試劑盒n濃縮、純化、脫鹽濃縮、純化、脫鹽:離心；離心

9、；超濾超濾; 透析透析; 凍干。凍干。n變性樣品變性樣品:qSDS：陰離子表面活性劑- 斷開氫鍵； 取消疏水作用 ； 去除多肽折疊；屏蔽蛋白電荷量。q高溫：高溫： 95100,515min（大多數(shù)蛋白）； 70,510min（多次跨膜蛋白）n還原樣品還原樣品:q-巰基乙醇：巰基乙醇：強(qiáng)還原劑-斷開二硫鍵,破壞二三級(jí)結(jié)構(gòu)q二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇(DTT) :還原劑-斷開二硫鍵,破壞二三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白樣品處理問(wèn)題蛋白樣品處理問(wèn)題蛋白樣品處理問(wèn)題蛋白樣品處理問(wèn)題待測(cè)蛋白狀態(tài)待測(cè)蛋白狀態(tài)凝膠條件凝膠條件上樣上樣bufferbuffer電泳電泳bufferbufferReduced-Reduced-Denat

10、uredDenatured還原，變還原，變性性含含-巰基乙醇或巰基乙醇或DTTDTT，含，含SDSSDS含含SDSSDSReduced-Reduced-NativeNative還原，不還原，不變性變性含含-巰基乙醇或巰基乙醇或DTTDTT，不含，不含SDSSDS不含不含SDSSDSOxidizedOxidized- -DenaturedDenatured不還原，不還原，變性變性不含不含-巰基乙醇或巰基乙醇或DTTDTT，含，含SDSSDS含含SDSSDSOxidized-Oxidized-NativeNative不還原，不還原，不變性不變性不含不含-巰基乙醇或巰基乙醇或DTTDTT，不含，不含

11、SDSSDS不含不含SDSSDS 根據(jù)目的蛋白的狀態(tài)確定電泳條件：根據(jù)目的蛋白的狀態(tài)確定電泳條件：u 抗體識(shí)別蛋白的空間型抗原表位時(shí)，不可加熱及SDS變性u(píng) 抗體識(shí)別蛋白的氧化狀態(tài)時(shí)，就不可加還原劑（ -巰基乙醇或DTT）n膠類型的選擇膠類型的選擇：PAGE、SDS-PAGE、tricine-SDS-PAGE 、IEF、2Dn膠的濃度選擇膠的濃度選擇：蛋白大小、數(shù)目、個(gè)人經(jīng)驗(yàn)n配膠時(shí)間配膠時(shí)間：q忌即配即用（防凝固不均）；q忌長(zhǎng)期冰箱放置（防SDS結(jié)晶）；q保存4天（防SDS水解聚丙烯酰胺）n配膠溫度配膠溫度：室溫或37n配膠試劑配膠試劑：qAP：現(xiàn)用現(xiàn)配或分裝凍存qTEMED ：最后加,邊加

12、邊晃qTris-HCl: 上下膠pH勿混(上6.8/下8.8)q丙烯酰胺: 神經(jīng)毒性配膠問(wèn)題配膠問(wèn)題蛋白分子量蛋白分子量（ku）凝膠濃度凝膠濃度（）（）4-402010-431512-601220-801025-200857-2125蛋白上樣問(wèn)題蛋白上樣問(wèn)題u 上樣的總蛋白量上樣的總蛋白量根據(jù)蛋白表達(dá)豐度及研究目的調(diào)整適當(dāng)?shù)牡鞍咨蠘恿?（ 20-70 ug 細(xì)胞/組織裂解液； 100 ng 純化蛋白；）u 上樣的總體積上樣的總體積 130 ul(小板)； 10 ul(大板）u 各孔上樣量一致各孔上樣量一致 每孔上樣量盡量保持一致，以防條帶傾斜u 上樣孔的選擇上樣孔的選擇 忌爛孔忌爛孔（因氧氣進(jìn)

13、入）、 忌不潔孔忌不潔孔（多因上膠位置玻璃未洗凈）、 忌不齊孔忌不齊孔（因上樣孔底部有氣泡、碎膠、 未沖孔、不均勻縮膠、不正確拔梳拔梳）等特點(diǎn)特點(diǎn)PVDF膜膜NC膜膜尼龍膜尼龍膜靈敏度和分辨率高高高高背景低低低較高蛋白結(jié)合能力100-200ug/cm2（適用于SDS存在時(shí)與蛋白結(jié)合）80-100ug/cm2400ug/cm2機(jī)械強(qiáng)度強(qiáng)強(qiáng)干的膜易脆軟而結(jié)實(shí)溶劑抗性強(qiáng)強(qiáng)差差使用前是否需要浸潤(rùn)緩沖液潤(rùn)濕緩沖液潤(rùn)濕適用染色方法膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁不能用陰離子染料適用檢測(cè)方法顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒光、放射性、化學(xué)熒光、快速免疫檢測(cè)顯色法、化學(xué)發(fā)光、熒

14、光、放射性顯色、化學(xué)發(fā)光、放射性適用范圍 普通蛋白WB、糖蛋白檢測(cè)、蛋白質(zhì)測(cè)序、氨基酸分析普通蛋白WB、氨基酸分析。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測(cè)常用價(jià)格高較低低膜的選擇問(wèn)題膜的選擇問(wèn)題PVDFPVDF膜的選擇問(wèn)題膜的選擇問(wèn)題轉(zhuǎn)膜緩沖液?jiǎn)栴}轉(zhuǎn)膜緩沖液?jiǎn)栴}最好現(xiàn)用現(xiàn)配最好現(xiàn)用現(xiàn)配!夾心結(jié)構(gòu)問(wèn)題夾心結(jié)構(gòu)問(wèn)題n夾心結(jié)構(gòu)夾心結(jié)構(gòu): 正濾、膜、膠、濾負(fù)n大小：大?。?濾紙=膜=膠n注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): 膜用甲醇預(yù)處理 膜隨時(shí)保持濕潤(rùn)（傳統(tǒng)） 盡量使用新濾紙 各層疊放次序正確 不能有氣泡n平衡問(wèn)題：平衡問(wèn)題：膜與膠泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中 5120minmi

15、n(蛋白分子愈小,時(shí)間愈短) 纖纖維維墊墊轉(zhuǎn)膜效果問(wèn)題轉(zhuǎn)膜效果問(wèn)題透視法透視法, 考馬斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色麗春紅（可逆）麗春紅（可逆）酰胺黑酰胺黑CPTS 總蛋白染色總蛋白染色. l麗春紅麗春紅S染色法：帶負(fù)電麗春紅染色法：帶負(fù)電麗春紅S與帶正電的氨基酸殘基及蛋白的非極性區(qū)結(jié)合與帶正電的氨基酸殘基及蛋白的非極性區(qū)結(jié)合,從而形成從而形成紅色條帶紅色條帶. l透視法：透視法：干燥干燥PVDF膜后，膜后，20%甲醇浸濕；甲醇浸濕；蛋白區(qū)透明方便、可逆、蛋白不損、無(wú)需染料蛋白區(qū)透明方便、可逆、蛋白不損、無(wú)需染料轉(zhuǎn)膜方式：轉(zhuǎn)膜方式：q電泳轉(zhuǎn)移(半干轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn))q虹吸轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)膜電壓：轉(zhuǎn)膜電壓： 10

16、25V（半干轉(zhuǎn)）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜電流： 12mA/cm2，10% gel轉(zhuǎn)膜問(wèn)題轉(zhuǎn)膜問(wèn)題虹吸轉(zhuǎn)移膜膜濾紙濾紙膠膠-+膜膜濾紙濾紙膠膠濾紙濾紙轉(zhuǎn)膜問(wèn)題轉(zhuǎn)膜問(wèn)題轉(zhuǎn)膜時(shí)間轉(zhuǎn)膜時(shí)間 根據(jù)蛋白分子量、膠濃度、具體情況決定。根據(jù)蛋白分子量、膠濃度、具體情況決定。檢測(cè)多個(gè)蛋白時(shí)，需進(jìn)行切膠，分別轉(zhuǎn)膜。檢測(cè)多個(gè)蛋白時(shí)，需進(jìn)行切膠，分別轉(zhuǎn)膜。d使用使用0.2m的的PVDF轉(zhuǎn)印膜（轉(zhuǎn)印膜（PSQ，呈淡藍(lán)色），呈淡藍(lán)色）d轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)增加甲醇（防止平衡時(shí)小分子流失）轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)增加甲醇（防止平衡時(shí)小分子流失）d轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)減少轉(zhuǎn)移緩沖液中適當(dāng)減少SDS（防止（防止SDS抑制膜與蛋白的結(jié)合）抑制膜與蛋白的結(jié)合）d降

17、低凝膠的平衡時(shí)間（降低凝膠的平衡時(shí)間（10min10min）d降低電泳轉(zhuǎn)膜時(shí)間（降低電泳轉(zhuǎn)膜時(shí)間（25min）dtricine-SDS-PAGE小分子蛋白的小分子蛋白的 “流穿流穿”問(wèn)題問(wèn)題封閉問(wèn)題封閉問(wèn)題, 定義定義: 使用含有惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑的緩沖液（PBST/TBST）封閉雜交膜上的非特異性位點(diǎn), 舉例舉例:non-fat milk(脫脂奶粉 BSA（胎牛血清） casein（酪蛋白）Tween-20（吐溫-20） gelatin(明膠) 商業(yè)化的封閉試劑 封封 閉閉牛牛E牛兔固相載體固相載體人源目的蛋白人源目的蛋白兔源二抗兔源二抗(抗?？古c段段)牛源一抗牛源一抗HRP兔E兔

18、源二抗兔源二抗胎牛血清胎牛血清封閉問(wèn)題封閉問(wèn)題注意事項(xiàng)注意事項(xiàng):l 抗磷酸化抗體不能用酪蛋白或含磷抗磷酸化抗體不能用酪蛋白或含磷酸酶的封閉液酸酶的封閉液.l 生物素、刀豆蛋白交聯(lián)二抗不用脫脂生物素、刀豆蛋白交聯(lián)二抗不用脫脂牛奶牛奶l 同種封閉液的批間差異同種封閉液的批間差異l 完全溶解、過(guò)濾去除難溶顆粒完全溶解、過(guò)濾去除難溶顆粒l 牛、羊、馬源的一抗盡量不用牛、羊、馬源的一抗盡量不用BSA或或脫脂奶粉脫脂奶粉 一抗一抗：根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)、種屬選擇合適一抗。根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)、種屬選擇合適一抗。注意一抗的種屬，單注意一抗的種屬，單/多克隆及適用方法等。多克隆及適用方法等。根據(jù)說(shuō)明書推薦或預(yù)實(shí)驗(yàn)

19、優(yōu)化最佳稀釋比例。根據(jù)說(shuō)明書推薦或預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳稀釋比例。加疊氮鈉，加疊氮鈉，分裝保存，忌反復(fù)凍融。分裝保存，忌反復(fù)凍融。 二抗二抗：根據(jù)一抗的來(lái)源種屬以及根據(jù)一抗的來(lái)源種屬以及Ig亞型（亞型（G、A、M等）選擇合適二抗。等）選擇合適二抗。選擇合適的標(biāo)記物（選擇合適的標(biāo)記物（HRP 、AP、 GOD、生物素、生物素、熒光素、膠體金）熒光素、膠體金）加或不加硫柳汞，加或不加硫柳汞， 分裝保存，忌反復(fù)凍融。分裝保存，忌反復(fù)凍融。根據(jù)說(shuō)明書推薦或預(yù)實(shí)驗(yàn)（根據(jù)說(shuō)明書推薦或預(yù)實(shí)驗(yàn)（Dot blotting）優(yōu)化最佳稀釋比例。）優(yōu)化最佳稀釋比例。n 抗體問(wèn)題抗體問(wèn)題Dot blot設(shè)置合適的對(duì)照組設(shè)置合適

20、的對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)目的蛋白，用于檢測(cè)抗體的工作效率陰性對(duì)照陰性對(duì)照：明確不表達(dá)目的蛋白，用于檢測(cè)抗體的特異性二抗對(duì)照二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性及stripping效果內(nèi)參對(duì)照內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)體系是否正常工作、進(jìn)行半定量分析空白對(duì)照空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的封閉及 stripping效果對(duì)照問(wèn)題對(duì)照問(wèn)題內(nèi)參問(wèn)題內(nèi)參問(wèn)題內(nèi)參名稱內(nèi)參名稱分子量大小分子量大小適用范圍適用范圍beta-actin43kDa胞漿和全細(xì)胞胞漿和全細(xì)胞GAPDH30-40kDa胞漿和全細(xì)胞胞漿和全細(xì)胞Tubulin55kDa胞漿和全細(xì)胞胞漿和全細(xì)胞VCDA1/Porin31kDa線

21、粒體線粒體COXIV16kDa線粒體線粒體Lamin B166kDa細(xì)胞核細(xì)胞核TBP38kDa細(xì)胞核細(xì)胞核h根據(jù)內(nèi)參蛋白與目的蛋白的分子大小選擇h根據(jù)內(nèi)參蛋白的存在部位h確定內(nèi)參不受實(shí)驗(yàn)處理因素影響z適用于檢測(cè)兩種分子量接近的蛋白適用于檢測(cè)兩種分子量接近的蛋白z適用于檢測(cè)目的蛋白的特定修飾狀態(tài)適用于檢測(cè)目的蛋白的特定修飾狀態(tài)z50,150200rpm,30min(需加需加-巰基乙醇巰基乙醇)z商品化溫和的洗脫液商品化溫和的洗脫液(37 ,60rpm,10,60rpm,1030min) z若不換抗體若不換抗體,可不可不Stripping而直接封閉加抗體而直接封閉加抗體檢測(cè)；檢測(cè)；z通過(guò)二抗對(duì)照

22、及空白對(duì)照檢測(cè)通過(guò)二抗對(duì)照及空白對(duì)照檢測(cè)Stripping效果；效果；StrippingStripping問(wèn)題問(wèn)題L 無(wú)信號(hào)無(wú)信號(hào)(白板白板)或或 弱信號(hào)弱信號(hào)(不是白板勝似白板不是白板勝似白板)L 高背景高背景(黑板、幾盡黑板黑板、幾盡黑板)L 非特異性條帶（雜帶）非特異性條帶（雜帶）L 臟帶（操作）、補(bǔ)丁染色臟帶（操作）、補(bǔ)丁染色L 表情條帶（微笑、皺眉）表情條帶（微笑、皺眉）L 鬧鬼（鬼帶、鬼影）鬧鬼（鬼帶、鬼影） L 拖尾、紋理、偏斜、過(guò)長(zhǎng)、過(guò)粗條帶拖尾、紋理、偏斜、過(guò)長(zhǎng)、過(guò)粗條帶L 其它其它WBWB常見(jiàn)問(wèn)題常見(jiàn)問(wèn)題樣品樣品l樣品中無(wú)目的蛋白或目的蛋白降解樣品中無(wú)目的蛋白或目的蛋白降解

23、- 設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照檢查封閉液檢查封閉液是否有蛋白酶是否有蛋白酶使用蛋白酶抑制劑使用蛋白酶抑制劑l上樣量不夠或蛋白表達(dá)豐度較低上樣量不夠或蛋白表達(dá)豐度較低-增加上樣量增加上樣量濃縮純化樣品濃縮純化樣品2. 2. 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l轉(zhuǎn)膜不完全轉(zhuǎn)膜不完全- - 轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色轉(zhuǎn)膜后使用麗春紅染色使用蛋白質(zhì)使用蛋白質(zhì)MarkerMarker.l洗滌過(guò)度洗滌過(guò)度-減少洗滌時(shí)間和次數(shù)減少洗滌時(shí)間和次數(shù). .3. 3. 封閉封閉l封閉過(guò)度封閉過(guò)度- - 減少封閉液濃度及封閉時(shí)間減少封閉液濃度及封閉時(shí)間更換封閉試劑更換封閉試劑4. 4. 抗體孵育和檢測(cè)頭抗體孵育和檢測(cè)頭l抗體濃度和孵育時(shí)間不夠抗體濃度

24、和孵育時(shí)間不夠- 增加抗體濃度增加抗體濃度延長(zhǎng)孵育時(shí)間延長(zhǎng)孵育時(shí)間l一抗不工作一抗不工作-設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照l(shuí)二抗不工作二抗不工作-和其他一抗配合檢測(cè)二抗是否工作和其他一抗配合檢測(cè)二抗是否工作l一抗一抗/ /二抗不匹配二抗不匹配-檢查抗體的來(lái)源和亞型。正確選擇二抗檢查抗體的來(lái)源和亞型。正確選擇二抗l底物失活或靈敏度低底物失活或靈敏度低- - 重新配制有效的底物重新配制有效的底物更換高靈敏度底物更換高靈敏度底物無(wú)信號(hào)無(wú)信號(hào)/弱信號(hào)問(wèn)題弱信號(hào)問(wèn)題(白板白板)1.1.封閉封閉l封閉時(shí)間不夠：封閉時(shí)間不夠：延長(zhǎng)封閉時(shí)間延長(zhǎng)封閉時(shí)間l優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度優(yōu)化封閉試劑的類型和濃度l封閉液和抗體有

25、交叉反應(yīng)：封閉液和抗體有交叉反應(yīng)：更換封閉液更換封閉液；加加Tween-20Tween-20減少交叉反應(yīng)減少交叉反應(yīng)l磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉液：磷酸化抗體不能使用含有酪蛋白的封閉液：推薦推薦BSABSA封閉封閉2.2.抗體孵育和檢測(cè)抗體孵育和檢測(cè)l一抗一抗/ /二抗二抗?jié)舛忍撸簼舛忍撸航档涂贵w濃度降低抗體濃度( (主要是二抗主要是二抗) )l孵育溫度太高：孵育溫度太高：建議建議4 4度孵育過(guò)夜度孵育過(guò)夜3.3.其他其他l洗膜不充分：洗膜不充分：5 5* *3mins3mins，多次短時(shí)間的洗膜，多次短時(shí)間的洗膜l曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：縮短曝光時(shí)間縮短曝光時(shí)間l出現(xiàn)干膜現(xiàn)象

26、：出現(xiàn)干膜現(xiàn)象：保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜保證膜充分浸透，避免出現(xiàn)干膜l二抗非特異性：二抗非特異性：設(shè)置只加二抗對(duì)照設(shè)置只加二抗對(duì)照背景高問(wèn)題背景高問(wèn)題(黑板黑板)背景高背景高底片曝光1.1.樣品制備樣品制備l二聚體或多聚體：二聚體或多聚體：還原變性電泳還原變性電泳l蛋白不同剪切體或蛋白不同剪切體或isoforms isoforms : :實(shí)驗(yàn)論證實(shí)驗(yàn)論證l蛋白降解：蛋白降解：使用新鮮樣品加蛋白酶抑制劑使用新鮮樣品加蛋白酶抑制劑l上樣量過(guò)大：上樣量過(guò)大：減少上樣量減少上樣量2.2.封閉封閉l封閉不充分：封閉不充分：優(yōu)化封閉時(shí)間和濃度優(yōu)化封閉時(shí)間和濃度3.3.抗體孵育和檢測(cè)抗體孵育和檢測(cè)l一抗

27、一抗/ /二抗?jié)舛冗^(guò)高：二抗?jié)舛冗^(guò)高：降低抗體濃度降低抗體濃度 ( (主要是一抗主要是一抗) )l抗體沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化抗體沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化: :純化或更換抗體純化或更換抗體l二抗非特異性結(jié)合：二抗非特異性結(jié)合：使用二抗對(duì)照使用二抗對(duì)照4.4.其他其他l洗膜保證充分洗膜保證充分雜帶問(wèn)題雜帶問(wèn)題 適當(dāng)稀釋一抗適當(dāng)稀釋一抗-提高特異性提高特異性 適當(dāng)稀釋二抗適當(dāng)稀釋二抗-降低背景降低背景二聚體或亞型二聚體或亞型雜雜帶帶目的條帶目的條帶操作問(wèn)題操作問(wèn)題l一抗?jié)舛炔粔蛞豢節(jié)舛炔粔? :增加一抗?jié)舛仍黾右豢節(jié)舛萳抗體孵育不均勻抗體孵育不均勻: :搖床搖床l干膜干膜: : 保持濕潤(rùn)保持濕潤(rùn)l 細(xì)菌污染細(xì)菌污染: :

28、加防腐劑或更換抗加防腐劑或更換抗體體配制新鮮緩沖液配制新鮮緩沖液補(bǔ)丁染色問(wèn)題補(bǔ)丁染色問(wèn)題補(bǔ)丁染色補(bǔ)丁染色n微笑條帶微笑條帶：主要由于凝膠中部聚合不完全，多見(jiàn)于較厚凝膠，也可由于上樣量過(guò)大- 室溫靜置充分凝固；調(diào)節(jié)上樣量n皺眉條帶皺眉條帶：凝膠和玻璃擋板底部有氣泡或凝膠兩邊聚合不完全或上樣量過(guò)大-在兩板間加入適量緩沖液完全凝膠重新配膠調(diào)整上樣量表情條帶表情條帶單孔皺單孔皺眉眉兩邊皺眉兩邊皺眉微笑條帶微笑條帶單孔微笑單孔微笑n拖尾現(xiàn)象：拖尾現(xiàn)象：主要是A.樣品融解效果不佳; B.電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng); C.分離膠濃度過(guò)大引起-加樣前離心 加適量樣品促溶劑重配電泳緩沖液降低凝膠濃度。n彌散現(xiàn)象：彌散現(xiàn)

29、象：樣品不溶性顆?；蚰滩怀浞只蛑颇z問(wèn)題- 加樣前離心； 加適量樣品促溶劑 充分凝固 重新配膠更換電泳液。 拖尾及彌散條帶拖尾及彌散條帶拖尾拖尾彌散彌散n “鬼帶鬼帶” ：A大分子構(gòu)象復(fù)雜蛋白質(zhì)分子未完全變性或輕微復(fù)性；B高含量高純度蛋白存在-充分變性還原；C 抗體的重輕鏈(加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化；分離或過(guò)濾樣品；抗體來(lái)源)n“鬼影鬼影” (條帶的中心透亮)：上樣量過(guò)大、目的蛋白過(guò)多-適當(dāng)減少上樣量鬼問(wèn)題鬼問(wèn)題鬼鬼影影目的條帶目的條帶鬼帶鬼帶n條帶偏斜條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜或蛋白上樣不均-正確安裝、加樣、上樣均勻n條帶兩邊擴(kuò)條帶兩邊擴(kuò)散散：加樣量過(guò)多-減少上樣量偏斜與擴(kuò)散偏斜與擴(kuò)散條帶偏斜條帶