甲胎蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的檢測(cè)

1、 檢測(cè)甲胎蛋白基因在轉(zhuǎn)檢測(cè)甲胎蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的的表達(dá)情況錄水平上的的表達(dá)情況 討論的題目 甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登錄號(hào): NM_001134.1)的異常表達(dá)與肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤有關(guān)，請(qǐng)根據(jù)基因表達(dá)的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案從轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)AFP的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)方案包括：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)方法及原理、技術(shù)路線、可能的結(jié)果分析及應(yīng)用等。 1、掌握Northern印跡雜交和RTPCR技術(shù)的方法2、了解實(shí)驗(yàn)的操作方法和步驟3、判斷基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)甲胎蛋白是腫瘤相關(guān)的胚胎特異-球蛋白

2、,分子量約為70kDa，是一直以來都被認(rèn)為是臨床診斷胎兒出生缺陷和肝細(xì)胞癌的經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物。正常情況下這種存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后就迅速消失，如果重現(xiàn)于成人血清中則提示有肝癌的可能。 AFP基因的DNA結(jié)構(gòu) AFP基因約為20kbp大小,由15個(gè)內(nèi)含子和14個(gè)外顯子組成,包含590個(gè)氨基酸,其中在N末端有19個(gè)氨基酸是信號(hào)肽序列。實(shí)驗(yàn)方法 1、 Northern印記雜交 2、核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn) 3、原位雜交 4、RTPCR技術(shù) 5、實(shí)時(shí)熒光定量PCRNorthern印跡雜交實(shí)驗(yàn)原理 Northern印跡雜交是指將RNA變性及電泳分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用雜交反應(yīng)來鑒

3、定其中特定mRNA 分子的含量及其大小的過程。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線1、提取mRNA2、瓊脂糖凝膠電泳分離RNA3、Northern印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠預(yù)處理4、Northern印跡轉(zhuǎn)移5、用標(biāo)記的RNA探針與轉(zhuǎn)移到固相支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交6、雜交結(jié)果的顯示結(jié)果分析 1、若出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細(xì)胞組織內(nèi)有AFP基因的表達(dá)，則會(huì)有患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。2、若沒有出現(xiàn)明顯雜交帶，則表明細(xì)胞組織內(nèi)基因未表達(dá)。應(yīng)用 Northern印記技術(shù)多用來檢查基因組中某個(gè)特定的基因是否得到轉(zhuǎn)錄以及

4、轉(zhuǎn)錄的相對(duì)水平。目前，Northern印記技術(shù)仍然被認(rèn)為是檢測(cè)基因表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理 逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶或隨機(jī)引物的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段檢測(cè)基因表達(dá)。試驗(yàn)技術(shù)路線 1、提取mRNA 2、反轉(zhuǎn)錄DNA鏈 3、PCR擴(kuò)增 4、凝膠電泳 5、結(jié)果顯示反轉(zhuǎn)錄酶的選擇 1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶 2 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶。 4MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H突變體引物設(shè)計(jì)的原則 1、長(zhǎng)度及堿基分布 2、引物之間及引物自身 3、引物3端 4、引物5端 5、二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) 6、簡(jiǎn)并引物結(jié)果分析 1、若有AFP基因表達(dá)，則在與其反轉(zhuǎn)錄CDNA鏈分子量平行處應(yīng)有檢測(cè)信號(hào)。 2、若AFP基因未表達(dá)，則在與其反轉(zhuǎn)錄CDNA鏈分子量平行處沒有檢測(cè)信號(hào)。應(yīng)用 1、分析基因的表達(dá) 2、獲取目的基因 3、合成CDNA探針 Northern印跡雜交與PCR方法的比較 Northern印跡雜交技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平的敏感性較PCR技術(shù)低，但其特異性強(qiáng)，假