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文檔簡介
1、實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗二實驗二 普通光學顯微鏡的構造原理及使用方法普通光學顯微鏡的構造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的構造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的構造原理及使用方法細胞形態(tài)結構與幾種細胞器的觀察細胞形態(tài)結構與幾種細胞器的觀察實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗目的實驗目的熟悉普通光學顯微鏡的主要結構和基本性能。掌握低倍鏡、高倍鏡和油鏡的正確使用方法。初步了解光學顯微鏡的維護方法。在普通光學顯微鏡下識別細胞和細胞器的形態(tài)結構,掌握生物繪圖的方法。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗原理實驗原理 詳見講義實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法目鏡目鏡鏡筒鏡筒物鏡轉換器物鏡轉換器物鏡物鏡
2、聚光器聚光器光圈光圈燈室燈室標本移動器螺旋標本移動器螺旋鏡座鏡座栽物臺栽物臺鏡臂鏡臂粗調節(jié)器粗調節(jié)器細調節(jié)器細調節(jié)器實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法幾種特殊顯微鏡的使用 實驗目的:實驗目的: 了解相差顯微鏡、熒光顯微鏡、暗視野顯微鏡的原理、構造以及應范圍廣泛;掌握這幾種顯微鏡基本的操作步驟。 實驗要求: 了解普通光學顯微鏡的構造及其原理,并熟練掌握其操作方法。具備一定的物理學光學知識。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法一、相差顯微鏡 實驗原理:實驗原理: 人的眼睛只能感覺光波的波長(顏色)和振幅(亮度)的變化?;畹募毎臀慈旧臉吮径酁闊o色透明,光波通過時,光波和
3、振幅并不發(fā)生變化,因而,常采用固定和染色等各種理化措施,使被檢物體的顏色和亮度發(fā)生變化,以利識別。另一方面,即使是近于無色透明的細胞和標本,各部分的折射率和厚度也會有微小的差異。當光波通過時,在各部分的滯留時間就會不同,即光程會有微小的不同,因而光波的相位會發(fā)生微小的變化。 人眼不能識別相位的差異,但相差顯微鏡能夠將相差變?yōu)檎穹靼担┎?,從而使我們可以利用相差顯微鏡直接觀察活細胞或未染色的標本的細微結構。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 相差顯微鏡將相位差轉變振幅差,是利用了光的衍射和干涉現(xiàn)象。 光源射出的光線通過被檢物體時,如果是完全均質透明的物體,光線將繼續(xù)沿直線前進,稱為直射光;如果是
4、含有折射率略有不同的物體,一部分仍為相位和振幅相同的直射光,另一部分由于光的衍射現(xiàn)象則向周圍側方分散前進,這種光稱為衍射光。衍射光速度比衍射光大約低1/4波長。當直射光和衍射光同時到達一點時,兩者相互干涉,形成合成波。合成波的大小取決于兩個光波的振幅和相差。如果振幅相等,相差為零,即波峰與波峰相遇,其合成波則有兩倍的振幅,產生的相長干涉(同向量),最為明亮。若一個光的相位推遲,其合成波減小,光度漸暗,當恰好推遲半個波長(1/2)時,即波峰與波谷相遇,則兩個光波的振幅相互抵消,合成波發(fā)生相消干涉(異向量),則成為黑暗狀態(tài)。 在普通光學顯微鏡中,盡管光波通過被檢物體后也發(fā)生了衍射,直射光與衍射光也
5、發(fā)生了干涉而形成合成波,但因衍射的速度比直射光大約低1/4(而不是1/2或0)波長,所以合成波的振幅與直射光的振幅相同,即被檢物體與背景間不能形成明暗反差,我們很難看到被檢物體。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 若在直射光的通過點放置推年遲相位的物質,將直射光推遲1/4波長,使之與衍射光保持同一像相位,合成波等于直射波與衍射波振幅之合,振幅加大被檢物體亮度提高。若同時在直射光的通過點放置吸收光的物質,則直射光的振幅減弱,致使僅由直射光照射的背底變暗,被檢物體的亮度相對年進一步提高。 相反,若在大部分衍射光的通過面放置推遲相位的物質,把衍射光推遲1/4波長,兩者的相差變?yōu)?/2波長,合成波的振幅
6、等于兩波的振幅差,這時,被檢物體亮度低于周圍介質。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 下面介紹相差顯微鏡的構造: 1. 環(huán)狀光闌: 由大小不同的環(huán)狀孔組成的光闌,與聚光器一起組成轉盤聚光器。外面標有10 x,20 x,40 x,100 x字樣,相應地與不同倍率的物鏡配合使用。環(huán)狀光闌的作用是將直射光所成的像與衍射光旁像分開。 2. 相板: 安裝在相差物鏡后焦面上。相板分為兩部分,即通過直射光的共軛面和通過衍射的補面。相板上鍍有吸收膜和相位膜,以推遲直射光(衍射光的相位)并吸收直射光(或衍射光),從而使亮度發(fā)生變化。 相板的種類很多,相差物鏡種類的也很多。 3. 合軸調中望遠鏡: 用以調整環(huán)狀光闌
7、所造成的像與相板共軛面完全吻合。相差顯微鏡在使用時,聚光鏡下面的環(huán)狀光闌的光環(huán),應與相差物鏡中的相位相互吻合,完全一致,否則,直射光和衍射光的光路紊亂,應被吸收的光不能被吸收,相位該推遲的光波不能被推遲,失去相差顯微鏡的作用。由于環(huán)狀光闌的光環(huán)與物鏡相板的環(huán)孔甚小,為使二者相互對準,完全重合,必須使用合軸調中望遠鏡。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗步驟實驗步驟 1. 安裝好環(huán)狀光闌和相差物鏡。 2. 在明視野條件下對光,調焦。 3. 拔出目鏡,插入合軸望遠鏡,用左手指固定其外筒,一邊看著望遠鏡,一邊用右手轉動內筒升降,對準焦點叫能看到環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板黑環(huán),將望遠鏡固定,升降聚光器并調節(jié)
8、其下的螺旋,使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致,再旋轉聚光器兩側的條調節(jié)鈕,使光環(huán)和黑環(huán)完全重合。 4. 拔出望遠鏡,插入目鏡,即可觀察。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 注意事項:注意事項: 在更換不同倍率相差物鏡和不同種類的相差板時,要重新合軸調中。使用油物鏡時,聚光器上透鏡表面與栽片之間要同時上鏡油。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法二、熒光顯微鏡 實驗原理:實驗原理: 熒光是熒光物質受光或其它射線時所發(fā)出的可見光,其特點是:吸收了能量即刻發(fā)光,光或其它射線停止照射時也叫立即停止發(fā)光。 熒光分為兩種:自發(fā)性熒光和繼發(fā)性熒光。自發(fā)性熒光指動植物組織和細胞內的某些成分經短波照射后發(fā)出的微弱熒光;繼發(fā)性熒光
9、指某些細胞成分與熒光染料結合而在照射后呈現(xiàn)出的熒光。熒光染料的種類很多,并且對年各種被檢物體表現(xiàn)出不同的親和性。 熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源,經過濾色系統(tǒng),發(fā)出一定波長的光(紫蘭光42mm或紫外光365mm)做為激發(fā)光,激發(fā)標本的熒光物質使其發(fā)出熒光,再經過物鏡和目鏡的放大進行觀察。 熒光顯微術是生物,醫(yī)學中的重要研究手段,可以研究細胞內的自發(fā)熒光物質,更重要的是可以研究不同熒光探針標記后的細胞及其化學成分。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 下面介紹熒光顯微鏡的構造: 1. 熒光光源:一般用超高壓汞燈,它的紫外和紫蘭部分有很強的發(fā)射。 2. 濾色系統(tǒng):由激發(fā)濾光片和吸收濾光片組成。
10、 3. 激發(fā)濾光片:提供一定波長的激發(fā)光。激發(fā)光的波長根據(jù)備激發(fā)的熒光物質而定。 4. 吸收濾光片:把不需要的激發(fā)光吸收掉而只讓所需要的熒光通過,同時也保護眼睛不受激發(fā)光的影響。吸收濾光片必須與激發(fā)濾光片配合使用。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗步驟實驗步驟 1. 制備標本:取蛙血作血涂片,注意涂片時使血滴位于兩片栽片的夾角中,移動上面的栽片時,代動血液前進,而不能推進血滴。將涂片浸入甲醇中固定5min,然后再轉入1/1000丫啶橙 (熒光染料)水溶液中染色35min,水沖洗,干燥。 2. 打開熒光顯微鏡燈源,超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到最亮。注意:超高壓汞燈不能反復開關,點燃15min
11、后才能關;關閉5min后才能開。汞燈開時,不能開室內照明燈。 3鏡檢標本,可見紅細胞的細胞核發(fā)橙色熒光,胞漿暗綠色,有時可見細胞核呈不規(guī)則的白細胞。注意:標本照射時間過長,會發(fā)生熒光減弱現(xiàn)象。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法三、暗視野顯微鏡 實驗原理:實驗原理: 暗視野顯微鏡是以丁達爾現(xiàn)象(即光的微粒散射現(xiàn)象)為基礎,利用特殊的聚光器(如拋物面聚光器)進行斜射照明,它不讓光柱自下面而上地通過標本,不讓強度很大的光線直接進入物鏡,到達觀察者的眼睛。因此,我們在暗視野中所看到的既不是照明的光線,也不是標本本身,而是備檢物體的衍射光圖象。 由于以上原因,暗視野顯微鏡只能看到物體的存在和運動,不能辯清
12、物體的細微結構。但普通光鏡的最大分辨率僅為0. 2m,而在暗視野顯微鏡下,盡管看不清物體的細微結構的,卻可以分辯小至0. 004m,據(jù)此我們可以說暗視野顯微鏡的分辨率高于普通光鏡。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 下面介紹暗視野顯微鏡的構造: 暗視野顯微鏡與普通光鏡相比,在構造上的差別就在于用暗視野聚光器代替普通聚光器,并且所用的物鏡的鏡口率一般小于0. 85,這樣使照明的線不進入物鏡,造成暗視野。 暗視野聚光器的種類很多,常見的為拋物面聚光器,這種聚光器的下面設有中央遮光板,以遮掉光源中部的光柱,只讓邊緣的筒狀光柱通過,拋物面使筒狀光束改變行走方向,呈斜射途徑前進,會聚于標本的位置上,但不進
13、入物鏡,而標本散射出來的光進入物鏡。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 1. 安裝暗視野聚光器,并選用強光源。 2. 在聚光器和載玻片之間滴加香柏油,目的是防止照明光線于聚光鏡上面進行全反射,達不到被檢物體,從而得不到暗視野照明。 3. 調節(jié)聚光器的焦點對準被檢物。首先調節(jié)聚光器的中心,使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格地在一條線上,然后操縱聚光器調節(jié)螺旋,使其升降,把焦點對準被檢物體,以圓錐形光束頂點照射物體。 4. 示范觀察:示范觀察變形蟲裝片及葉片柵欄細胞裝片。暗視野顯微鏡在下觀察活的動植物細胞,看不清內部的細微結構,只能觀察到細胞,細胞器的輪功廓。尤如黑夜里看星星,在黑暗的背景里看到細胞所
14、反射或衍射的光線形成的像。變形蟲細胞內細胞質的流動及柵欄細胞內原生質的流動均可看到。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法實驗步驟實驗步驟人血涂片細胞觀察 分別用低倍鏡和高倍鏡觀察血細胞的形態(tài)。洋蔥根尖切片細胞的觀察 先用低倍鏡觀察,尋找細胞形狀規(guī)則、形態(tài)清晰的區(qū)域,換高倍鏡觀察細胞內部結構。馬蛔蟲受精卵切片中心體的觀察實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法作業(yè)作業(yè)為什么使用高倍鏡和油鏡時,必須從低倍鏡開始?顯微鏡下看到的物像是正像還是反像?物像與玻片的移動方向是否一致?為什么?簡述使用顯微鏡的注意事項。繪制你所看見的各種細胞和細胞器,并標示出各部分(注意:細胞器外形特點、大小、分部、位置、數(shù)目)。實驗二顯微鏡的構造原理及使用方法 1. 相差顯微鏡有哪些特有的附件?其構造如何? 2. 為什么相差顯微鏡可以直接觀察活體樣本? 3. 簡述相差顯微鏡,熒光顯
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