SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)報(bào)告重點(diǎn)講義

1、生化實(shí)驗(yàn)總結(jié)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)名稱：SDS - PAGE法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量 作者： 田景輝（201306230114） 專業(yè)： 生物工程 指導(dǎo)教師： 許培雅 日期： 2015.12.30 組員：楊瑞 徐巧妹 尹彪 程健 劉嘉南目 錄一、實(shí)驗(yàn)介紹3二、實(shí)驗(yàn)原理3三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、器皿4四、操作步驟5五、注意事項(xiàng)7六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理 7七、總結(jié)與建議 8八、術(shù)語表9九、參考文獻(xiàn) 9十、附錄9一、實(shí)驗(yàn)介紹1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誗DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的技術(shù)。2. 實(shí)驗(yàn)背景在實(shí)驗(yàn)一中，用100g新鮮酵母用甲苯自溶法、研磨法、SDS（十二烷基苯磺酸鈉）法進(jìn)行了蔗糖酶的提取以及粗提取

2、，得到初提取液A、熱提取液B、乙醇提取液C。最終得到9.0ml蔗糖酶初提取液。實(shí)驗(yàn)二采用QAE-葡聚糖凝膠離子交換柱層析法進(jìn)行蔗糖酶的純化，得到經(jīng)線性階梯洗脫的分離液D1和經(jīng)階梯梯度洗脫的分離液D2。實(shí)驗(yàn)三采用苯基瓊脂糖凝膠柱層析法進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到經(jīng)2mol/L (NH4)2SO4的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 緩沖液洗脫的分離液E1和經(jīng)2mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl ph7.3 緩沖液洗脫的分離液E2。二、實(shí)驗(yàn)原理 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，

3、由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。生物化學(xué)上指在進(jìn)行SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）中由于凝膠孔徑的不連續(xù)性（2種孔徑）、緩沖

4、液離子成分的不連續(xù)性(2種緩沖體系)、PH值（3種PH）和電位梯度的不連續(xù)性使得蛋白質(zhì)分子在濃縮膠和分離膠的界面處濃縮成一條狹小的縫帶，成為濃縮效應(yīng)。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、器皿(1).試劑材料：1、30%丙烯酰胺貯液：丙烯酰胺（Acr作為單體） 29.2g，甲叉雙丙烯酰胺 (Bis作為交聯(lián)劑）0.8g，溶解于雙蒸水100ml，中樞神經(jīng)毒物凝聚后無毒。2、10%的N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)：0.1mlTEMED+0.9ml雙蒸水（凝固加速劑）；3、10過硫酸銨溶液（凝固的催化劑）； 4、分離膠緩沖液貯液（1.5molL Tris-HCl，pH8.8）；5、濃縮膠緩沖液貯液（1mol

5、L Tris-HCl，PH6.8）；6、2×SDS-樣品緩沖液：1ml濃縮膠緩沖液貯液 + 4ml 10%SDS + 1ml疏基乙醇 + 2ml甘油 + 0.5ml 0.1%（w/v）溴酚藍(lán)（電泳指示劑），加雙蒸水至10ml。4保存；7、SDS-電極緩沖液貯存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1SDS，pH8.3）：在900ml雙蒸水中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS貯液，加雙蒸水補(bǔ)至1000ml則成5×SDS-電極緩沖液；8、10% SDS：25g SDS用雙蒸水溶解至250ml，室溫保存； 9、

6、染色液：0.25gR250考馬斯亮藍(lán)溶于90ml甲醇水（11，v/v）和10ml冰乙酸的混合液10、脫色液：50ml甲醇加75ml冰乙酸，加蒸餾水至1000ml；11、蛋白質(zhì)樣品液12、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：包括兔磷酸化酶B，MW97400；牛血清蛋白，MW66200；兔肌動(dòng)蛋白， MW43000；牛碳酸酐酶，MrW31000；胰蛋白酶抑制劑，MW20100；雞蛋清溶菌酶，MW14400。蛋白質(zhì)樣品液：1.初提液A 2.乙醇提取液C 3.離子層析柱分離液D1(QAE-葡聚糖凝膠離子交換劑) 4.離子層析柱分離液D2(DEAE-葡聚糖凝膠離子交換劑) 5.疏水層析柱分離液E1(phenyl bestaro

7、se 6 Fast Flow) 6.疏水層析柱分離液E2(Octyl Sepharose 4 Fast Flow) (2).儀器：容量瓶、移液管、試管及試管架、移液槍、玻璃板、膠架、電泳槽等四、操作步驟1. 制膠1.1組裝膠架 將潔凈、無水的玻片對(duì)齊，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭頭向上，并確保下端平齊。放于制膠架上夾緊，下端緊貼密封條。1.2 分離膠的配置 1.2.1 12%分離膠配方如下表：12%膠蒸餾水30丙烯酰胺貯存液分離膠緩沖液 PH 8.810%SDS10%AP(過硫酸銨)TEMED10ml3.3 ml4.0 ml2.50 ml0.10 ml0.1 ml0.04ml1.2.2

8、 灌膠 混勻后用移液槍將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長(zhǎng)、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm)。 12.3液封 在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，使膠面平整。靜置約30min觀察膠面變化，當(dāng)看到水與凝固的膠面有折射率不同的界限時(shí)，表明膠已完全凝固，倒掉上層水，并用濾紙吸干殘留的水液。1.3濃縮膠的配置 1.3.1 5%濃縮膠配方下表：4%膠蒸餾水30丙烯酰胺貯存液分離膠緩沖液 PH 6.810%SDS10%AP(過硫酸銨)TEMED4 ml2.7 ml0.67 ml0.5ml0.04 ml0.04 ml0.04 ml1.3.2插入制膠梳 混勻后用移液槍將凝膠溶液注入到長(zhǎng)

9、、短玻璃板間的狹縫內(nèi)(分離膠上方)，輕輕加入樣品模板梳，小心避免氣泡的出現(xiàn)。約30分鐘，聚合完全。2. 加樣品將樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液分別與2×SDS-樣品緩沖液等體積混合，100水浴加熱3-5分鐘。將制好的凝膠平板裝進(jìn)垂直平板電泳槽。下槽放進(jìn)SDS-電極緩沖液，凝膠底部要保證沒有氣泡。將與SDS-樣品緩沖液混合后的樣品液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)各20l加入到樣品槽中，小心地與SDS-電極緩沖液充滿樣品槽，然后在上槽加入SDS-電極緩沖液。3. 電泳3.1 安裝電泳槽 將制備好的凝膠板取下，小心拔下梳子。兩塊10%的凝膠板分別插到U形橡膠框的兩邊凹形槽中，可往上提起使凝膠板緊貼橡膠。將裝好玻璃板的

10、膠?？蚱椒旁谘龇诺馁A槽框上，其下緣與貯槽框下緣對(duì)齊，放入電泳槽內(nèi)。3.2電泳在電極槽中倒入pH8.3Tris-HCl電極緩沖液，內(nèi)含0.1%SDS即可進(jìn)行電泳。在制備濃縮膠后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，因?yàn)闀?huì)破壞pH環(huán)境，如需要電泳只能在分離膠聚合后，并用分離膠緩沖液進(jìn)行。預(yù)電泳后將分離膠面沖洗干凈，然后才能制備濃縮膠。開始電流為10mA左右，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為20-30mA，當(dāng)染料前沿距離凝膠底部邊緣1,。5cm時(shí)，停止電泳關(guān)閉電源。4. 染色和脫色電泳結(jié)束后，取出凝膠平板，移去玻璃板，將凝膠浸泡于染色液中，染色4h，然后進(jìn)行脫色液脫色，數(shù)小時(shí)換一次脫色液，直至背景無色。為加速脫色可將脫色液加熱

11、。5. 樣品相對(duì)分子質(zhì)量確定以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgMW為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移距離為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移距離，從標(biāo)準(zhǔn)曲線所得方程求出其相對(duì)分子質(zhì)量。相對(duì)遷移距離=蛋白質(zhì)分子遷移距離/染料遷移距離五、注意事項(xiàng)1、根據(jù)目的蛋白的大小選擇合適的膠片濃度。一般為100KD-50KD選用10%膠；50KD-30KD選用12%膠；30KD-10KD選用15%膠。2、要根據(jù)樣品濃度來加樣品溶解液。每加一個(gè)樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后再點(diǎn)另一個(gè)樣品。3、制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，倒膠后常漏出膠液，那是因?yàn)槎K玻璃板與塑料條之間沒封緊，留有空隙，所以這步要特別留心操作。4、電

12、泳完畢撬板取凝膠時(shí)要小心細(xì)致不能把膠弄破。5、電泳緩沖液可重復(fù)利用，如果膠上出現(xiàn)不正常痕跡，就要及時(shí)更換新液。6、分離膠高度控制得當(dāng)，確保有大約1cm左右的濃縮膠空間。過長(zhǎng)或過短均不能得到理想的電泳結(jié)果。7、電泳染色液注意進(jìn)行回收再利用，一般可重復(fù)使用2-3次。8、AP和TEMED是催化劑，加入的量要合適，過少則凝膠聚合很慢甚至不聚合，過多則聚合過快，影響倒膠。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理由于制備凝膠的時(shí)候存在濃度誤差，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品其中兩條沒有分離出來，可能是由于分子質(zhì)量過大，沒有跑下來。第一組：提取液A中有一條帶明顯，標(biāo)準(zhǔn)蛋白有五條帶較明顯，其他的不明顯，無法識(shí)別。第二組：和第一組情況相同，

13、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品只有5條帶明顯，A、B中明顯的帶后來消失不見，說明那是雜蛋白，且濃度較大；C、D、E中的帶很模糊，可能是因?yàn)閷游龊笾率姑笣舛冗^低。七、總結(jié)與建議 本次實(shí)驗(yàn)是整個(gè)實(shí)驗(yàn)的最后一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，也是對(duì)之前實(shí)驗(yàn)的一次總結(jié)。實(shí)驗(yàn)相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果處理也比較簡(jiǎn)單，但由于我們小組在制膠時(shí)存在較大誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想，但是后續(xù)的結(jié)果處理還是能測(cè)定出我們組的蔗糖酶的分子量大小。通過本次實(shí)驗(yàn)，我們掌握了凝膠電泳的作用原理以及操作方法。八、術(shù)語表1.凝膠：凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整個(gè)體系會(huì)轉(zhuǎn)變成一種彈性的半固體狀態(tài)的稠厚物質(zhì)，失去流動(dòng)性。這種現(xiàn)象稱為

14、膠凝作用，所形成的產(chǎn)物叫做凝膠或凍膠。2.電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳(electrophoresis, EP)。利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。九、參考文獻(xiàn)1 何忠效 ,張樹政. 2009. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)叢書: 電泳M. 北京:科學(xué)出版社.2 朱運(yùn)峰 ,馮東曉 , 李春海. 2008聚丙烯酰胺凝膠電泳在 分離小分子物質(zhì)中的應(yīng)用 J. 生物技術(shù)通訊 , 9 ( 3 ) : 303 - 305.3 孫培龍 ,吳石金. 2008. 生物化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo): SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.十、附錄第一組原始數(shù)據(jù)記錄表蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量