蛋白質(zhì)組學(xué)分析確認(rèn)由Adaphostin誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

1、浙江理工大學(xué)本科畢業(yè)論文外文翻譯 蛋白質(zhì)組學(xué)分析確認(rèn)由Adaphostin誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激蛋白質(zhì)組學(xué)分析確認(rèn)由Adaphostin誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 姓 名： 王芳 2011 年 2月 28 日原文出處： Luke H. Stockwin；Proteomic Analysis Identifies Oxidative Stress Induction byAdaphostin J. Clin Cancer Res. 2007,13(12):3667-81 蛋白質(zhì)組學(xué)分析確認(rèn)由Adaphostin誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激摘要：目的：由于激活的BCR/ABL完全不同于被抑制的BCR/ABL，使得adaphosti

2、n被描述為''可探尋作用機(jī)制的藥物''。在這項(xiàng)研究中，adaphostin治療髓系白血病細(xì)胞株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步闡明了其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：用adaphostin分別處理 HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞6,12和24小時(shí)，然后用二維電泳分析，取表達(dá)差異位點(diǎn)，用胰蛋白酶消化，再用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。利用對(duì)苯二酚（1,4苯二酚）或過(guò)氧化氫處理的HL60細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析氧化還原活性氫醌基團(tuán)對(duì)adaphostin的作用。結(jié)果： adaphostin處理的細(xì)胞經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)49個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中大部分是在與氧化應(yīng)激或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。有趣的是，當(dāng)加入一種抗氧化劑N

3、-acetylcysteine，這些蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用幾乎完全被阻止。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)證實(shí)GSTP1可以作為一種adaphostin抗性基因。隨后對(duì)苯二酚或者雙氧水處理過(guò)的HL60細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物增加，該結(jié)果和經(jīng)adaphostin處理過(guò)的細(xì)胞具有相似的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜。 通過(guò)蛋白免疫印跡法鑒定發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶與抗adaphostin有關(guān)，通過(guò)苯二酚抑制SOD可增強(qiáng)adaphostin敏感性分析表明SOD作為adaphostin第二抗性基因，然而轉(zhuǎn)染SOD后卻會(huì)降低毒性。重要的是，1,4苯二酚或過(guò)氧化氫處理后的adaphostin誘導(dǎo)BCR/ABL多肽降解，這表明激酶抑制是一種依賴活性氧

4、的現(xiàn)象。結(jié)論：Adaphostin應(yīng)被歸類為氧化還原活性物質(zhì)，可替代對(duì)苯二酚。Adaphostin是一個(gè)十分有效的抗癌藥，但是他的作用機(jī)制尚不清楚。作為酪氨酸磷酸化抑制劑家庭一員，該化合物是一種結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)酪氨酸酶抑制劑激酶。Adaphostin最初確定為AG957類似物，一個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性ATP抑制劑p210Bcr/abl類似物。Adaphostin和 AG957 對(duì)惡性細(xì)胞增生的影響與p210bcr/abl多肽降解和快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。Adaphostin比AG957促進(jìn) BCR/ABL的體外降解的能力要高3-4倍，Adaphostin促進(jìn)BCR / ABL的體外降解能力是AG957的3

5、- 4倍，它能稍微加強(qiáng)3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的活性， 這種機(jī)制與ATP依賴的抑制劑BCR/ABL相比，能防止未經(jīng)磷酸化多肽降解，并且在經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間曝光誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。更多的跡象表明兩者的結(jié)構(gòu)不同， adaphostin 和STI571可以協(xié)同對(duì)抗T-淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株，而且adaphostin可以殺死抗STI571細(xì)胞，這為它們的結(jié)構(gòu)不同提供了進(jìn)一步的證據(jù)。在adaphostin顯示出具有使白血病和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系不表達(dá)BCR/ABL后，adaphostin對(duì)BCR/ABL特異性

6、受到質(zhì)疑。這導(dǎo)致有人認(rèn)為adaphostin是一個(gè)專一性不強(qiáng)的激酶抑制劑。有報(bào)道認(rèn)為，adaphostin誘導(dǎo)細(xì)胞死亡時(shí)伴隨著活性氧的增加。由于adaphostin包含一個(gè)取代基，具有轉(zhuǎn)移電子產(chǎn)生超氧化物自由基的的能力，從而提高活性氧的含量。為支持這一假說(shuō)，對(duì)1,4-對(duì)苯二酚的研究就非常重要。另一種可能的解釋來(lái)自于最新關(guān)于cDNA列陣的研究，研究表明cDNA能增加與鐵代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而增加ROS的產(chǎn)生。隨后有人解釋adaphostin能促進(jìn)鐵螯合物釋放游離的二價(jià)鐵，這可能會(huì)催化形成有毒的羥基自由基通過(guò)反應(yīng)H2O2 + Fe2+Fe3+ + OH-。盡管通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了大量數(shù)據(jù)，但是幾個(gè)

7、問(wèn)題仍然沒(méi)有解決，反應(yīng)中的基本分子還有待確定。例如，adaphostin已被證明能夠抑制分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，從而有人提議，adaphostin就像其他此類化合物（如SU5416，semaxanib）具有抗血管生成活性。同樣，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變和adaphostin對(duì)某些惡性腫瘤具有選擇性需要進(jìn)一步關(guān)注。在這項(xiàng)研究中，我們采用以二維電泳為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)來(lái)識(shí)別adaphostin的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)和作用機(jī)制。通過(guò)兩個(gè)adaphostin處理過(guò)的髓系白血病細(xì)胞系裂解所有細(xì)胞，HL60細(xì)胞（BCR/ABL陰性）和K562（BCR/ABL陽(yáng)性），形成了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡作用的蛋

8、白質(zhì)組學(xué)分析是一致的。調(diào)節(jié)蛋白GSTP1被轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中去抵抗adaphostin。adaphostin治療通過(guò)接觸到一個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)苯二酚或過(guò)氧化氫發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)構(gòu)基本相同，包含以adaphostin為核心的生物學(xué)氧化還原作用機(jī)制。這促使我們對(duì)抗氧化酶的作用進(jìn)一步分析，從而把超氧化物歧化酶I作為抗adaphostin的標(biāo)記?？傊?，簡(jiǎn)單的對(duì)苯二酚和過(guò)氧化氫也能以類似的方式影響的BCR/ABL的多肽降解治療adaphostin，這表明抑制酪氨酸激酶的活性是一種間接的事件與增加氧化應(yīng)激有關(guān)。材料與方法材料：Adaphostin(NSC 680410)，所有細(xì)胞株來(lái)自于癌癥治療和診斷腫瘤科(Freder

9、ick, MD).，PBS和 RPMI，質(zhì)量生物制品；BCA蛋白檢測(cè)，Pierce；聚偏氟乙烯膜和所有凝膠，Invitrogen公司；;完整的蛋白酶抑制劑藥片和WST試劑，Roche。主要抗體如下：超氧化物歧化酶的I /II，過(guò)氧化氫酶，GSTP1和髓過(guò)氧化物酶，單克隆抗體；檢測(cè)p210Bcr/abl的癌基因, Calbiochem公司; H型肌動(dòng)蛋白，Sigma公司。二次辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體, Jackson Immunoresearch; 銅/鋅超氧化物歧化酶的表達(dá)構(gòu)造和控制基礎(chǔ)pCMV6- XL5來(lái)自O(shè)rigene技術(shù)。除非另有說(shuō)明，所有其他化學(xué)品和抑制劑為Sigma公司。細(xì)胞毒性和

10、細(xì)胞活力取濃度為104 /100L的細(xì)胞置于96個(gè)孔板治療24H，將樣品（10L）添加到適當(dāng)?shù)目装?，?7、濕潤(rùn)、充滿CO2 的培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)2-3小時(shí)，在37下，把收獲的細(xì)胞用玻璃纖維過(guò)濾器提取細(xì)胞，清水洗凈，甲醇干燥并計(jì)數(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡和壞死在確定凋亡和壞死細(xì)胞比例時(shí)，我們采用了Vybrant細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（分子探針），數(shù)據(jù)的采集和使用Cellquest控制的分析流式細(xì)胞流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）細(xì)胞周期分析處理的細(xì)胞收集后用PBS洗滌一次，將樣品懸浮于5 mL PBS溶液和滴入5ml70的冷乙醇。經(jīng)過(guò)5分鐘的培養(yǎng)，將細(xì)胞離心，懸浮在10毫升70冰乙醇，4保存1小

11、時(shí)，這些細(xì)胞用5 mL PBS和PBS的1毫升含50g/mL碘化丙啶（分子探針）和100微克g/mL核糖核酸酶A（Sigma公司）清洗兩次。在37培養(yǎng)1小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀的FL3- A通道進(jìn)行細(xì)胞周期分析。免疫印跡法處理后的細(xì)胞用PBS洗兩次，然后溶解在RIPA-CHAPS buffer，超聲裂解，離心除去不溶性物質(zhì)，依據(jù)制造商的指示用BCA蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)的含量。SDS-PAGE用10%的 NUPAGE膠進(jìn)行電泳，每個(gè)加樣孔10ug蛋白。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。膜用含4%牛奶的TBS液封閉過(guò)夜，然后與1抗孵育2h，之后用含4%牛奶的TBS液洗滌膜多次，再與酶標(biāo)二抗孵育2h。條帶

12、用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL進(jìn)行顯色。蛋白質(zhì)羰基的測(cè)定。HL60 cells (15x 106 每 30 mL)用5mol/ L的adaphostin或者100mol/ L H2O2培養(yǎng)一段時(shí)間。然后用PBS洗滌細(xì)胞，加入0.5ml濃度為0.2 mol/L NaPO4，其中包含1mmol/L的EDTA和蛋白質(zhì)抑制酶。超聲波處理2次，每次10s，然后離心除去不溶性物質(zhì)。蛋白濃度測(cè)定采用BCA蛋白檢測(cè)，羰基測(cè)定，0.2ml的2mg/ml蛋白沉淀16 三氯乙酸（終濃度）。球團(tuán)懸浮于1毫升2 mol / L鹽酸（對(duì)照組），室溫下，黑暗環(huán)境中孵育30分鐘，渦旋每五分鐘。然后樣品加入16三氯乙酸（終濃度）冰箱

13、孵育5分鐘，然后離心五分鐘。沉淀物用乙醇/乙酸乙酯（1:1）混合液洗滌三次，溶解于0.1毫升6 mol / L的鹽酸胍2mol/ L的鹽酸。離心5分鐘除去不溶性物。2,4二硝基苯處理的樣品與2 mol / L的鹽酸處理的樣品差光譜測(cè)定結(jié)果之間差別在366NM處用22,000（mol/L）-1cm-12,4-二硝基苯的摩爾消光系數(shù)谷胱甘肽- S -轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定。谷胱甘肽- S -轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定用分光法測(cè)定谷胱甘肽巰基共軛到1 -氯-2,4二硝基苯在340 nm。離心（懸浮細(xì)胞）或刮（貼壁細(xì)胞）收集細(xì)胞，在冰冷的環(huán)境中加入100 mmol / L的磷酸鉀其中包含2 mmol / L EDTA和蛋

14、白酶抑制劑超聲10s，離心，消除任何不溶性物質(zhì)。用BCA蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度?；钚匝醯臋z測(cè)收集細(xì)胞，用PBS洗滌一次，然后使其懸浮在1x106ml/mL的含血清的培養(yǎng)基中。然后在37下不同adaphostin濃度中分組培養(yǎng)1H，CM-H2DCFDA（分子探針），其能與過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的綠色熒光，加入到最終濃度為10mol/ L溶液中培養(yǎng)1H，用PBS洗滌細(xì)胞2次，流式細(xì)胞儀分析儀上使用FL1通道。超氧化物歧化酶I和GSTP1轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了使用Amaxa Nucleofector技術(shù)，簡(jiǎn)言之，用PBS洗滌細(xì)胞后，2x106細(xì)胞懸浮于100L以備轉(zhuǎn)染，加入2g質(zhì)粒DNA，與懸浮液混勻，倒入Ama

15、xa試管，使用適當(dāng)?shù)碾娏鞔碳まD(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后，把細(xì)胞懸浮在完整的培養(yǎng)液中，裝到96孔板，37培養(yǎng)14小時(shí)，然后分別加入不同濃度的adaphostin如上面所說(shuō)的。Two-dimensional PAGE向細(xì)胞中加入5mol/L (HL60細(xì)胞)或者 30mol/L (K562 細(xì)胞)adaphostin，分別培養(yǎng)6,12,24小時(shí)。此外HL60細(xì)胞還要50mol/ L的對(duì)苯二酚，100mol/ L H2O2或者adaphostin 10 mmol/ L的L-NAC處理24h，然后用PBS洗滌細(xì)胞2次。使用BCA蛋白檢測(cè)蛋白質(zhì)，對(duì)于二維凝膠電泳，將21毫升培養(yǎng)細(xì)胞裂解在750L的細(xì)胞裂解/補(bǔ)液緩沖區(qū)

16、，細(xì)胞裂解物超聲兩次10秒，然后離心除去不溶性物質(zhì)。對(duì)于第一維電泳，第一維電泳，用裂解/補(bǔ)液緩沖液來(lái)將200g蛋白樣本進(jìn)行調(diào)整到450g。并用24cm的條。在Ettan IPGphor設(shè)備上進(jìn)行等電聚焦，20，每帶最大80A，按下列程序：0V下4小時(shí)，30v下7小時(shí)（補(bǔ)液），200v下1小時(shí)，500v下1小時(shí)，1000v下1小時(shí)，8000v下8到12小時(shí)（等電聚焦），直到達(dá)到60到100Kv-h。經(jīng)過(guò)等電聚焦，凝膠條分別切成三等分塊，通過(guò)溫和的震蕩20分鐘使其平衡，每一個(gè)溶液包含50 mmol/L Tris-HCl（PH6.8）6 mol / L尿素，30甘油，2% w/v SDS和一點(diǎn)溴酚藍(lán)

17、。將2% dithioerythritol添加到第一個(gè)平衡步驟中，2.5% w/v碘乙酰胺添加到第二個(gè)平衡步驟，對(duì)于第二個(gè)方面，膠條的NuPAGE被放置在4至12羥甲基甲烷凝膠頂部，用0.5瓊脂糖NuPAGE MES SDS的緩沖液密封，200v跑400分鐘，然后通過(guò)熒光染色法染成紅寶石色，同時(shí)用胰蛋白酶消化，水洗，7醋酸和10甲醇固定，30分鐘，染色過(guò)夜。為了減少背景熒光，凝膠在7乙酸，10甲醇中脫色30分鐘。凝膠用風(fēng)級(jí)9200成像儀成像。凝膠切割和膠內(nèi)蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化將蛋白質(zhì)從紅寶石染色的膠條上切離到96孔板上，用100 mmol/ L甲酸銨碳酸氫鹽清洗凝膠點(diǎn)兩次。用乙腈對(duì)凝膠點(diǎn)進(jìn)行脫

18、水，在真空離心壓縮集中器SC110A中干燥，用50 mmol / L的碳酸氫銨緩沖液包含12.5g/L的測(cè)序級(jí)豬胰蛋白酶使干凝膠點(diǎn)進(jìn)行再水化45分鐘在冰箱里。等到凝膠點(diǎn)再次膨脹，剩下的緩沖液用50 mmol / L的碳酸氫銨替代掉，然后37消化16小時(shí)，除去上清液，先用25 mmol / L的碳酸氫銨提取胰蛋白酶多肽，此后每20分鐘加入5甲酸。合并后的提取物，以及消化后上清，在真空離心壓縮集中器中風(fēng)干，然后溶入10L的1甲酸，5的乙腈，然后質(zhì)譜分析。質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定所使用的技術(shù)涉及微毛細(xì)管液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。用芬尼根離子阱質(zhì)譜儀對(duì)胰蛋白酶消化的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行了分析，由此產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件通過(guò)Masc

19、ot進(jìn)行了分析。結(jié)果建立蛋白質(zhì)組學(xué)分析條件. Adaphostin治療與蛋白質(zhì)合成的抑制和凋亡誘導(dǎo)迅速有關(guān)。一些檢查被用來(lái)研究adaphostin對(duì)HL60（BCR/ABL陰性）和K562（BCR/ABL陽(yáng)性）細(xì)胞的影響，闡明了蛋白質(zhì)組學(xué)的最適合的條件，第一組的實(shí)驗(yàn)測(cè)量了adaphostin對(duì)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞活力效果的影響72小時(shí)以上。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中， adaphostin對(duì)HL60和K562細(xì)胞取得最大的效果是第一個(gè)24小時(shí)，當(dāng)adaphostin濃度為50%時(shí)，第1、2、3天的濃度分別為0.35，0.3，0.4mol/ L，3.5，2.5和3.0mol/ L的K562細(xì)胞。細(xì)胞的IC50值

20、分別是1.0,1.5和1.5mol/LHL60細(xì)胞；10,7和7mol/LK562細(xì)胞分別在第1、2、3天。在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，BCR/ABL的陰性細(xì)胞株，HL60細(xì)胞對(duì)adaphostin敏感度是BCR/ABL陽(yáng)性細(xì)胞株K562細(xì)胞的5到10倍。在第二組的實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀是用來(lái)監(jiān)測(cè)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)現(xiàn)象通過(guò)使用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶。當(dāng)HL60和K562細(xì)胞的響應(yīng)時(shí)間為1.0，10mol/ L的膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)adaphostin含量檢查顯示增加在4小時(shí)后，24小時(shí)后大部分的細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V/碘化呈陽(yáng)性。此外，對(duì)HL60和K562細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析顯示，adaphostin治療后，亞二倍體細(xì)胞DN

21、A含量的百分比增加，這些數(shù)據(jù)支持上面的結(jié)論，即BCR/ABL的表現(xiàn)不一定需要adaphostin的活動(dòng)。對(duì)adaphostin處理細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為了描述細(xì)胞誘導(dǎo)adaphostin蛋白質(zhì)組變化，對(duì)治療過(guò)的HL60和K562細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液進(jìn)行二維電泳。一個(gè)小型二維凝膠格式，將其24厘米等電聚焦非線性條（pH值3-10）分為三個(gè)8厘米塊劃分，并用3個(gè)4至12Bis-Tris Zoom凝膠，然后準(zhǔn)備Western blot分析。先分別用0.1，1和5mol/ L adaphostin分別曝光6，12和24小時(shí)顯示最佳的反應(yīng)，根據(jù)被調(diào)整過(guò)的斑點(diǎn)數(shù)量來(lái)觀察，均視為HL60細(xì)胞被5mol/L

22、adaphostin處理。觀察到K562細(xì)胞在各種濃度下的蛋白質(zhì)組剖面都沒(méi)變。提高adaphostin的濃度到30 mol/L，增加曝光時(shí)間12到24h，發(fā)現(xiàn)這是對(duì)K562最佳的。小型凝膠經(jīng)過(guò)復(fù)合染色后可以觀察到數(shù)百個(gè)斑點(diǎn)。手動(dòng)檢查染色后的凝膠，記錄斑點(diǎn)，只有通過(guò)這些斑點(diǎn)才能知道是不是要調(diào)整濃度做進(jìn)一步的分析。凝膠組分析顯示adaphostin誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞產(chǎn)生的60個(gè)斑點(diǎn)和K562細(xì)胞產(chǎn)生的59個(gè)斑點(diǎn)有一些差別。對(duì)HL60細(xì)胞時(shí)程分析表明，在6小時(shí)的時(shí)候大部分的反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生了：69下調(diào)蛋白質(zhì)和86%上調(diào)蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)， adaphostin治療是一個(gè)快速反應(yīng)。經(jīng)過(guò)12小時(shí)，他們分別上調(diào)9

23、2%和下調(diào)100%。上百種不同的蛋白斑點(diǎn)顯示表達(dá)趨勢(shì)和幾個(gè)參照斑點(diǎn)，切取紅寶石色染色的凝膠，用胰蛋白酶消化，并用納流噴霧微毛細(xì)管液相色譜串聯(lián)蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定。這項(xiàng)工作最終鑒定出79個(gè)蛋白斑點(diǎn)差異調(diào)節(jié)。在蛋白質(zhì)水平， HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞有19個(gè)差異，在K562細(xì)胞中8個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，只有1個(gè)蛋白下調(diào)，而在HL60細(xì)胞中，10個(gè)蛋白被調(diào)控著上調(diào)，這些結(jié)果表明，adaphostin治療誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組發(fā)生重大的變化。GSTP1表達(dá)抗adaphostinK562細(xì)胞中的抗氧化酶GSTP1上調(diào)為抗adaphostin物質(zhì)的研究提供了一個(gè)提示。調(diào)查K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染的GSTP1表達(dá)的增加是否會(huì)調(diào)節(jié)a

24、daphostin活動(dòng)，正如預(yù)期蛋白質(zhì)組的結(jié)果，對(duì)K562細(xì)胞的免疫印跡顯示GSTP1可以內(nèi)源性表達(dá)，轉(zhuǎn)染后，當(dāng)時(shí)的GSTP1水平大大提高。這樣說(shuō)明抗adaphostin性大大增加。在對(duì)HL60細(xì)胞嘗試相同的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用GSTP1轉(zhuǎn)染IGROV1細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其抗adaphostin能力增強(qiáng)。然而，總谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定揭示了生物活性和抗adaphostin性呈正相關(guān)。Adaphostin，1,4苯二酚，過(guò)氧化氫抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成。最近的研究adaphostin以活性氧作為中心機(jī)制引發(fā)了一個(gè)調(diào)查關(guān)于對(duì)苯二酚，1,4苯二酚或過(guò)氧化氫復(fù)制adaphostin某些方面的生物活性的觀

25、察。我們通過(guò)兩種不同的方法來(lái)驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞用不同濃度adaphostin，1,4苯二酚，或過(guò)氧化氫治療24小時(shí)，然后測(cè)定其蛋白質(zhì)的合成。結(jié)果表明：每一組都十分相似，經(jīng)過(guò)處理K562細(xì)胞的耐受性比HL60細(xì)胞要強(qiáng)，為了進(jìn)一步探討的活性氧的作用，adaphostin對(duì)蛋白質(zhì)合成是由抗氧化劑L-NAC 決定的。當(dāng)L-NAC衰減時(shí)，adaphostin對(duì)HL60細(xì)胞蛋白質(zhì)合成影響加強(qiáng)5倍，對(duì)K562細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成影響加強(qiáng)2.2倍。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞分別用adaphostin，對(duì)苯二酚，過(guò)氧化氫處理1小時(shí)，然后添加CM-H2DCFDA，

26、CM-H2DCFDA與過(guò)氧化物反應(yīng)生成綠色熒光分子。流式細(xì)胞儀分析顯示，在這兩種細(xì)胞系，熒光顯著增加隨著三種試劑加入。這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)adaphostin和對(duì)苯二酚和雙氧水具有相似性。Adaphostin提高蛋白質(zhì)羰基化反應(yīng)通過(guò)L-NAC阻斷一個(gè)過(guò)程。為了檢驗(yàn)adaphostin對(duì)蛋白質(zhì)羰基的影響，通過(guò)裂解adaphostin處理過(guò)不同時(shí)間的HL60細(xì)胞得到裂解液，由一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的2,4二硝基苯耦合分光光度測(cè)定法檢測(cè)。結(jié)果顯示，adaphostin和陽(yáng)性對(duì)照的時(shí)間依賴性增加蛋白質(zhì)羰基的最大羰基化，在8小時(shí)達(dá)到高峰。Adaphostin處理過(guò)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組剖面與對(duì)苯二酚或者過(guò)氧化氫處理過(guò)的相似，可以被L

27、-NAC逆轉(zhuǎn)，為了進(jìn)一步闡述的作用對(duì)苯二酚源性活性氧對(duì)adaphostin作用，HL60細(xì)胞通過(guò)1,4苯二酚，或者過(guò)氧化氫處理，然后通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)比。此外，抗氧化劑L-NAC對(duì)adaphostin處理過(guò)的細(xì)胞的影響也進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)adaphostin，1,4苯二酚或者過(guò)氧化氫處理過(guò)的細(xì)胞曝光后的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜是相似的。同時(shí)還通過(guò)一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cu/Zn超氧化物歧化酶能夠抑制adaphostin，而Adaphostin，對(duì)苯二酚，過(guò)氧化氫的影響酪氨酸激酶p210Bcr/abl降解。要確定是不是氧化應(yīng)激單獨(dú)誘導(dǎo)Bcr/ABL的多肽降解做了如下實(shí)驗(yàn)，通過(guò)不斷加大adaphostin，1,4苯二酚

28、或者過(guò)氧化氫的劑量來(lái)培養(yǎng)K562細(xì)胞24小時(shí)。結(jié)果表明，K562細(xì)胞里BCR/ABL的是優(yōu)先降解相對(duì)與H -肌動(dòng)蛋白當(dāng)加入adaphostin（3mol/ L）和1,4，dihyroxybenzene（30mol/ L）和或過(guò)氧化氫（50mol/ L）。此外，所有的治療導(dǎo)致c - Abl抗體反應(yīng)的高分子聚合的外觀。然后對(duì)adaphostin，1,4苯二酚或者過(guò)氧化氫使用抗氧化劑發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑不能恢復(fù)BCR/ABL的表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)凋亡途徑是在兩行積極來(lái)自于程序性細(xì)胞死亡的蛋白5。討論在這項(xiàng)研究中，通過(guò)髓系白血病細(xì)胞株的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以提供對(duì)假定的抗癌藥adaphostin的生物活性的了解。初

29、步實(shí)驗(yàn)支持adaphostin與抑制蛋白質(zhì)的合成，氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。對(duì)HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞使用二維電泳的分析表明改變了幾個(gè)生物途徑中幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)，主要是有關(guān)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)的。關(guān)于細(xì)胞凋亡，從已知的蛋白酶底物裂解片段，確定了這兩個(gè)細(xì)胞系。同樣的，遠(yuǎn)的上游元件結(jié)合蛋白2在原始形狀下的下調(diào)可能會(huì)表現(xiàn)蛋白酶裂解的一個(gè)方面。進(jìn)一步證實(shí)凋亡途徑是程序性細(xì)胞死亡的蛋白5（PDCD5蛋白）檢測(cè)水平的提高和降低磷酸酶的水平。程序性細(xì)胞死亡的蛋白5的表達(dá)顯著提高，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，證明了磷酸酶是細(xì)胞生存所必需的。識(shí)別更多的HL60細(xì)胞的蛋白酶裂解產(chǎn)物比K562細(xì)胞更能為以細(xì)胞為基礎(chǔ)的蛋

30、白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)和時(shí)間進(jìn)程的反應(yīng)提供了依據(jù)。這進(jìn)一步證實(shí)了向下過(guò)渡是在HL60細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶調(diào)解下進(jìn)行的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶通過(guò)激活細(xì)胞核nB因子途徑抗細(xì)胞凋亡。與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的幾種蛋白質(zhì)同時(shí)也在HL60細(xì)胞和K562細(xì)胞受到調(diào)制。這樣的一個(gè)例子是鈣結(jié)合蛋白鈣調(diào)蛋白。活性氧和Ca2+之間存在廣泛而復(fù)雜的相互作用。氧化應(yīng)激條件下，鈣調(diào)蛋白的關(guān)鍵蛋氨酸殘基被選擇性氧化，允許它來(lái)調(diào)節(jié)多種蛋白激酶和磷酸酶的活性。一個(gè)重要的改變途徑僅限于HL60細(xì)胞有關(guān)糖酵解酶aenolase，丙酮酸激酶和甘油三磷酸脫氫酶調(diào)節(jié)，翻譯后修飾的糖酵解酶被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力傳感器。在最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，氧化劑，包括過(guò)

31、氧化氫，顯示出了羰基化反應(yīng)和糖酵解酶包括aenolase，丙酮酸激酶和甘油三磷酸脫氫酶誘導(dǎo)的多肽降解。在大腸埃希氏大腸桿菌的研究中，A -烯醇化酶是H2O2-或者O2-調(diào)節(jié)羰基化反應(yīng)的主要目標(biāo)之一。因此，氧化應(yīng)激的''傳感器''正在調(diào)制，這反映了的較高水平的活性氧存在于HL60細(xì)胞。一些的蛋白質(zhì)組專門(mén)為K562細(xì)胞提供分子基礎(chǔ)增加抗adaphostin性的相對(duì)HL60細(xì)胞。這II型分子伴侶是細(xì)胞生存不可或缺的，而K562細(xì)胞的增殖細(xì)胞核抗原調(diào)控可能是一種保護(hù)機(jī)制。除了DNA復(fù)制的作用，PCNA還參與核苷酸錯(cuò)配堿基切除修復(fù)。增殖細(xì)胞核抗原水平的增加可能因此提高K5

32、62細(xì)胞對(duì)細(xì)胞DNA損傷造成的壓力的承受能力。同樣，脅迫誘導(dǎo)蛋白ERp29也是受到K562細(xì)胞調(diào)控。雖然這個(gè)分子伴侶的生物學(xué)功能尚不清楚，研究使用ERP29過(guò)度表達(dá)的大鼠甲狀腺細(xì)胞株以證明ERp29會(huì)與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶協(xié)同蛋白質(zhì)折疊和分泌。最引人注目的是一個(gè)關(guān)于adaphostin反應(yīng)修改所涉及的解毒酶GSTP1，這個(gè)酶是在K562細(xì)胞中表達(dá)的。這個(gè)代謝酶對(duì)于保護(hù)在氧化應(yīng)激下的細(xì)胞起著重要作用。GSTP1的轉(zhuǎn)錄受到抗氧化劑接收器的控制。GSTP1超表達(dá)已被用于抗阿霉素和瘤可寧，而臨床上， GSTP1的表達(dá)水平增加是一個(gè)不好的指標(biāo)。在此，觀察到在GSTP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)adaphostin活性明

33、顯減弱，為耐藥性提供了一個(gè)有力的證據(jù)。同樣地，觀察到全部谷胱甘肽S -轉(zhuǎn)移酶活性和adaphostin活性之間的關(guān)系證明了這類酶家族具有抗adaphostin性。 在結(jié)構(gòu)上，adaphostin由一個(gè)氫醌結(jié)構(gòu)和惰性adamantyl集團(tuán)組成。在堿性條件下，氫醌被超氧自由基和各自醌氧化，若干報(bào)告表明，氫醌的氧化還原活性，或許可以解釋一些由于adaphostin引起的生物現(xiàn)象。有趣的是，在關(guān)于對(duì)苯代謝物對(duì)HL60細(xì)胞影響的研究中，簡(jiǎn)單的氫醌被確認(rèn)為有效的活性氧發(fā)生器。對(duì)苯二酚處理后發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，并抑制蛋白質(zhì)的合成和分泌單核細(xì)胞因子。在這里，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)苯二酚1,4-苯二酚處理后活性

34、氧會(huì)快速增加，并發(fā)現(xiàn)， adaphostin處理的細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜幾乎相同。因此，一個(gè)合乎邏輯的想法就比較adaphostin比作一個(gè)簡(jiǎn)單的活性氧發(fā)生器，如過(guò)氧化氫。HL60細(xì)胞對(duì)過(guò)氧化氫的敏感度為K562細(xì)胞的2倍，反應(yīng)了這些細(xì)胞系對(duì)adaphostin的敏感性。蛋白質(zhì)組學(xué)分析過(guò)氧化氫處理的HL60細(xì)胞發(fā)現(xiàn)幾乎相同的剖面，這些結(jié)果支持活性氧是由adaphostin上的苯二酚基團(tuán)直接產(chǎn)生的效應(yīng)機(jī)制。然而， adaphostin的 adamantyl基團(tuán)的重要性不容忽視，這種惰性非極性基團(tuán)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以提高幾種生物分子膜的透性，這也許可以解釋的adaphostin活性增加相對(duì)1,4苯二酚。考慮到對(duì)苯二酚氧化能力是與超氧離子的生成有關(guān)，我們推測(cè)，抗氧化酶特別是超氧化物歧化酶可能改變adaphostin的活性，在這方面，對(duì)在不同細(xì)胞系的抗氧化酶進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)，最終是通過(guò)表達(dá)Cu/Zn超氧化物歧化酶I來(lái)抗adaphostin，更加有力的證據(jù)是轉(zhuǎn)染了超氧化物歧化酶I的細(xì)胞產(chǎn)生了抗性，然而用超氧化物歧化酶I抑制劑預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)毒性增加了。