病毒的分離鑒定學(xué)習教案

1、會計學(xué)1病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定第一頁，編輯于星期日：十八點 二十二分?！叭汤滏溔汤滏湣钡?頁/共21頁第二頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。1 1動物接種動物接種動物分離病毒法：乳小白鼠（動物分離病毒法：乳小白鼠（3日齡）日齡）優(yōu)點：優(yōu)點：很敏感，易掌握；病毒可隨傳代次數(shù)的增加而增強，有利于病毒分離；缺點：缺點：小白鼠本身存在多種病毒性疾病，往往會影響結(jié)果；小鼠也可能存在個體差異；接種途徑：接種途徑：腦內(nèi)接種腦內(nèi)接種皮下接種皮內(nèi)接種腹腔接種肌肉接種靜脈接種實驗動物的觀察：實驗動物的觀察：動物的發(fā)育、活動力、食欲和糞便特殊癥狀：震顫、弓背、不安、嗜睡、癱瘓、抽搐等直至死亡有些實驗還需

2、測量動物的體溫和體重第2頁/共21頁第三頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。（1）原代和次代細胞培養(yǎng) （2）二倍體細胞培養(yǎng) （3）傳代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng) （4）病毒在培養(yǎng)細胞中增殖的指標 1）細胞病變 2）紅細胞吸附 3）干擾現(xiàn)象 4）細胞代謝的改變 組織培養(yǎng)分離法：組織培養(yǎng)分離法：沒有隱性感染沒有隱性感染沒有免疫能力的抵抗力沒有免疫能力的抵抗力接種量大接種量大培養(yǎng)條件易于控制培養(yǎng)條件易于控制加速病毒的分離過程加速病毒的分離過程漢坦病毒敏感的培養(yǎng)細胞漢坦病毒敏感的培養(yǎng)細胞l首先發(fā)現(xiàn)人肺癌細胞（A549）l其他敏感細胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等2 2組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)第3頁/共2

3、1頁第四頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。細胞病變（細胞病變（CPE ）：）：1、分布均勻的小顆粒狀破壞病變；2、局灶狀小顆粒狀破壞；3、細胞圓化，呈局灶性葡萄狀的堆積；4、細胞融合。圓縮；脫落；聚集；破碎；第4頁/共21頁第五頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。3雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：對大多數(shù)病毒均較敏感，其病毒繁 殖量較高； 來源方便、經(jīng)濟，管理方便；缺點：缺點：操作不當污染，導(dǎo)致胚胎死亡；4蚊蟲分離病毒法蚊蟲分離病毒法經(jīng)口感染經(jīng)口感染胸腔接種胸腔接種優(yōu)點：優(yōu)點：病毒可長時間保存在蚊體內(nèi)； 蚊蟲飼養(yǎng)較實驗動物容易，數(shù) 量大；缺點：缺點：必須經(jīng)常了解蚊子體內(nèi)是否確 已帶毒；第5頁/共

4、21頁第六頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。第6頁/共21頁第七頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。1）蝕斑（蝕斑（plaque）測定）測定 可進行病毒的分離純化； 蝕斑形成單位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或感染量或50%組織感染量（組織感染量（ID50或或TCID50）測定）測定（一）（一）病毒的數(shù)量與感染性測定病毒的數(shù)量與感染性測定 二、病毒的鑒定結(jié)晶紫染色中性紅染色第7頁/共21頁第八頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。 1）病毒核酸類型的測定）病毒核酸類型的測定 2）理化性狀的檢測：大小及結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等）理化性狀的檢測：大小及

5、結(jié)構(gòu)、衣殼對稱類型、有無包膜等 3）血清學(xué)鑒定）血清學(xué)鑒定 ELISA；IFA；（二）（二）病毒理化性質(zhì)及血清學(xué)鑒定病毒理化性質(zhì)及血清學(xué)鑒定第8頁/共21頁第九頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。陽性分離物上清陽性分離物上清提取總提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成反轉(zhuǎn)錄合成cDNA直接測序或克隆測序直接測序或克隆測序PCR擴增擴增（三）（三）病毒分子生物學(xué)鑒定病毒分子生物學(xué)鑒定第9頁/共21頁第十頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。什么是聚合酶鏈式反應(yīng)什么是聚合酶鏈式反應(yīng)n聚合酶鏈式反應(yīng)（聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是一種在體外特異地擴增已知基因的方法；是

6、一種在體外特異地擴增已知基因的方法；由由K. Mullis于于1983年建立年建立；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可進行實時、定量分析可進行實時、定量分析；可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與DNA序列的序列的相互作用。相互作用。 第10頁/共21頁第十一頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理PCR操作過程操作過程1、預(yù)變性（預(yù)變性（Initial denaturation）：）： 模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95加熱3-5分鐘；2、引物退火（引物退火（Primer annea

7、ling）：）：退火溫度一般需要憑實驗經(jīng)驗決定，退火溫度對PCR的特異性有較大影響；3、引物延伸（引物延伸（Primer elongation）：）：引物延伸一般在72 進行（Taq酶最適溫度），延伸時間隨擴增片段長短而定；4、循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中的變性步驟：循環(huán)中一般95，30秒足已使各種靶DNA序列完全變性，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗；5、循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)：大多數(shù)PCR含25-35個循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異條帶；6、最后延伸：最后延伸：在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72 維持5-15分鐘，使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。第11頁/共21頁第十二頁，編輯于

8、星期日：十八點 二十二分。PCR的各種變體的各種變體反向PCR（Inverse PCR，IPCR）不對稱PCR（Asymmetric PCR）多重PCR熒光定量PCR（Q-PCR）反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）巢式PCR（NEST PCR）遞減PCR（Touchdown PCR）第12頁/共21頁第十三頁，編輯于星期日：十八點 二十二分?？捎糜诳捎糜趍RNA的半定量分析的半定量分析 反 轉(zhuǎn) 錄反 轉(zhuǎn) 錄P C R ( r e v e r s e transcription-PCR，RT-PCR) 是是一種簡單、快捷地對一種簡單、快捷地對RNA進

9、行定性、進行定性、定量分析的方法。它是以定量分析的方法。它是以mRNA為為模板，體外擴增模板，體外擴增cDNA，再以，再以cDNA為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的的PCR擴增。擴增。RT-PCR技術(shù)一般用于技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測，則可對待測RNA樣品進行半定量分樣品進行半定量分析。析。該方法適合對待測樣品進行初步該方法適合對待測樣品進行初步篩選，目前已廣泛被實時定量篩選，目前已廣泛被實時定量PCR替代。替代。1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCRTrans反轉(zhuǎn)錄酶系列 第13頁/共21頁第十四頁，編輯于星期日：十八點 二十二分

10、。 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 實時定量實時定量PCR (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是定量分是定量分析析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。有很高的靈敏度和特異性。2實時定量實時定量PCRSYBR Green實時定量實時定量PCR分析原理示意圖分析原理示意圖 第14頁/共21頁第十五頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。*目前有目前有5種技術(shù)用于實時定量種技術(shù)用于實時定量

11、PCR 其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用其中最經(jīng)濟、簡便的技術(shù)是利用熒光染料熒光染料（如（如SYBR Green ）與雙鏈）與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加；分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴增產(chǎn)物的增加； 其他其他4種方法都是以熒光染料標記的寡核苷酸為探針與正種方法都是以熒光染料標記的寡核苷酸為探針與正確的擴增子雜交，包括確的擴增子雜交，包括5核酸酶法核酸酶法（即人們熟知的（即人們熟知的TaqManTM）、）、分子信標分子信標、ScropionsTM和和探針雜交法探針雜交法，它們擁有更強，它們擁有更強的特異性，可以避免對的特異性，可以避免對PCR后溶解曲線的需求，以及后后溶解曲線的需求

12、，以及后續(xù)的續(xù)的Southern雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是雜交或?qū)U增子的測序鑒定，但是成本較高成本較高。第15頁/共21頁第十六頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。芯片技術(shù)芯片技術(shù)nDNA芯片（芯片（DNA chip）在固相支持物上有序固化寡在固相支持物上有序固化寡核苷酸或核苷酸或DNA探針，與待探針，與待測熒光標記樣品進行雜交；測熒光標記樣品進行雜交；通過對雜交信號的檢測、比較通過對雜交信號的檢測、比較和分析，得出樣品的遺傳信息和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達基因序列及表達)； 亦被稱作亦被稱作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)?；蛐酒ぷ髁鞒袒蛐酒ぷ髁?/p>

13、程第16頁/共21頁第十七頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。三、生物信息學(xué)是預(yù)測基因組結(jié)構(gòu)和功三、生物信息學(xué)是預(yù)測基因組結(jié)構(gòu)和功能的重要手段能的重要手段n數(shù)據(jù)庫的建設(shè)：數(shù)據(jù)庫的建設(shè)：匯集匯集了大量了大量DNA序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)信息信息預(yù)測基因、基因產(chǎn)物的結(jié)預(yù)測基因、基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能；分析基因構(gòu)、功能；分析基因-基基因、基因因、基因-產(chǎn)物、產(chǎn)物產(chǎn)物、產(chǎn)物-產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)系；描述細胞或整體水平系；描述細胞或整體水平的基因表達譜；推測系統(tǒng)的基因表達譜；推測系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。發(fā)生關(guān)系。人類X染色體圖譜第17頁/共21頁第十八頁，編輯于星期日：十八點 二十二分。NC

14、BI數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫NCBI首先創(chuàng)建首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 于于19911991年開發(fā)了年開發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及MEDLINEMEDLINE有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地有關(guān)序列的文獻信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起結(jié)合在一起NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳還提供了其他數(shù)據(jù)庫，包括在線人類孟德爾遺傳( (OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（MMDB）、人類基因序列集）、人類基因序列集成（成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類）、生物門類（Toxonomy） 等數(shù)據(jù)庫等數(shù)據(jù)庫第18頁/共21頁第十九頁，編輯于星期日：十八點 二十