《生化產(chǎn)品檢測與》的實驗

1、生化產(chǎn)品檢測與分析的實驗教案1直接滴定法測定豆奶粉中總糖的含量2苔黑酚法測定RNA的含量3氣相色譜法測定食用酒中乙醇含量（內(nèi)標法）或液相色譜法測VC含量4生物傳感器的制作及其葡萄糖濃度的測定實驗一 直接滴定法測定豆奶粉中總糖的含量還原糖包括葡萄糖、果糖、麥芽糖。在測定還原糖時一般測定總糖時所有將糖類水解為轉(zhuǎn)化糖再測定的方法都可用來測定還原糖。一 實驗目的1 掌握費氏試劑法測定還原糖含量的方法2 學習糖類測定時澄清劑的選擇方法二實驗原理：淀粉等多糖在強酸下進行水解獲得還原性糖。將一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍色的氫氧化銅沉淀；沉淀很快與酒石酸鉀反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀

2、鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉淀；這種沉淀與亞鐵氰化鉀絡合成可溶的無色絡合物；二價銅全部被還原后，稍過量的還原糖把次甲基藍還原，溶液由蘭色變?yōu)闊o色，即為滴定終點；根據(jù)樣液消耗量可計算出還原糖含量。三設備與耗材水浴鍋，容量瓶，三角燒瓶（250 ml），柄皿（100 ml），可調(diào)電爐，滴定管，移液管，漏斗四試劑（1）    斐林氏A液：稱15g五水硫酸銅和0.05g亞甲基藍溶于水中轉(zhuǎn)入1000ml容量瓶中并定容。（2）    斐林氏B液：稱50g酒石酸鉀鈉

3、及75gNaOH溶入水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解后，用水稀釋至1000 ml貯存于橡膠塞玻璃瓶內(nèi)。（3）0.1%甲基紅指示劑：稱取0.1g甲基紅加60%的乙醇溶解并稀釋至100ml放在滴瓶里待用。（4）乙酸鋅溶液：稱取21.9g乙酸鋅加3 ml冰乙酸加水溶解并定容至100ml（5）10.6%亞鐵氰化鉀溶液（6）6M HCl：量取50ml HCl加水稀釋至100 ml（7）20% NaOH溶液（8）1mg/mL葡萄糖標準溶液：精密稱取1.000g經(jīng)過98-100干燥至恒重的葡萄糖，加水溶解后加入5 ml鹽酸并用水稀釋定容至1000 ml。五操作步驟1樣品處理：稱取2.5g樣品于50mL燒

4、杯用100mL80的水分次溶解并倒入250mL容量瓶中，搖勻后慢慢加入5mL乙酸鋅液和5mL亞鐵氰化鉀，搖勻后定容，靜置半小時用干燥濾紙過濾，去初濾液，液備用。2糖水解后得樣液：吸取50mL濾液于250mL容量瓶中加5mL6M HCl在68-70水浴中保溫15min，冷卻后加1滴甲基紅指示劑用20% NaOH溶液中和至中性，加水定容作為待測液。3標定費氏試劑：吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以先快后慢的速度滴加至藍色剛好褪去為終點，記錄下來，平行三份。計算出費氏試劑相當?shù)钠咸烟呛浚╩g）。4樣品溶液預測吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，控制2mi

5、n內(nèi)加熱至沸趁沸以先快后慢的速度滴加樣液至藍色變淺以每秒一滴的速度滴定至藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積。5正式滴定：吸A、B液各5ml到柄皿中，加水10ml，加比預定量少1.0ml樣液2分鐘內(nèi)要求沸騰趁沸以每秒一滴的速度滴定至藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積。平行三次。6計算：F：與10ml斐林氏試液相當?shù)霓D(zhuǎn)化糖毫克數(shù)，V1：樣品試液總體積V2：樣品試液滴定量W：樣品重量7思考題（1）本法采用的澄清劑是什么，為什么不采用銅鹽作為澄清劑？（2）堿性酒石酸銅甲液和乙液為什么要分別貯存，用時才混合？（3）滴定時為什么必須在沸騰條件下進行？（4）樣品溶液預測的目的是什么？實驗二 苔黑酚法測定

6、RNA的含量一、原理 當RNA與苔黑酚(3，5-二羥基甲苯) 在沸水中加熱時，RNA被酸降解，所產(chǎn)生的核糖進一步轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡c苔黑酚在高鐵離子的催化下可反應生成綠色復合物，后者在670nm處有最大吸收峰，在10100mg/mL范圍內(nèi)其吸光度值與RNA濃度有線形關系。二、試劑和器材 1. 試劑（1）標準RNA母液準確稱取RNA10.0mg，用少量水溶解（如不溶可滴加濃氨水，調(diào)pH7.0），定容至10mL，此溶液為1mg/mL。（2）0.1mg/mL標準RNA溶液（配制10mL）；（3）苔黑酚-三氯化鐵試劑（臨用時配配制）：將100mg苔黑酚溶于100mL濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3&#

7、183;6H2O。（4）10%硫酸溶液（5）5%硝酸銀溶液（配制50mL）(6)0.2%氫氧化鈉溶液（配制50mL）此外還有干酵母粉，無水乙醇，氨水，無水乙醚(500mL，分析純）2瓶，乙酸，氫氧化鈉。三氯乙酸，CuCl2·H2O。2. 器材 可見分光光度計、恒溫水浴鍋三、操作步驟1RNA的提取稱取8g干酵母粉于100燒杯中，加入0.2%氫氧化鈉溶液40 mL，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。冷卻加入乙酸數(shù)滴使pH為5-6(用石蕊試紙試)，離心10-15分鐘（4000轉(zhuǎn)/分鐘）取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，邊加邊攪拌。靜置過濾，濾渣用乙醇洗2次，每次體積約10 mL，繼而用乙醚洗2

8、次，每次體積約10 mL。乙醚濾干后，濾渣作為粗RNA，作鑒定和測定含量用。2. 鑒定 取上述RNA約0.5g，加10%硫酸溶液5mL，加熱至沸1-2分鐘，將RNA水解。(1)吸水解液0.5 mL，加苔黑酚-三氯化鐵試劑1mL，加熱至沸1分鐘觀察顏色變化；（2）吸水解液2 mL，加氨水2 mL及5%硝酸銀溶液1 mL，觀察是否產(chǎn)生絮狀的嘌呤銀化合物。（有時絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。3. 標準曲線的繪制 取12只試管分成6組，按下表操作。取2管的平均值，以DNA濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。4 樣品的測定將一定量的RNA粗品用水溶解并定容，RNA濃度在10100mg/mL范

9、圍內(nèi)，取1.0mL樣液于6號試管中，加水1.0mL及苔黑酚-三氯化鐵試劑2.0mL，沸水浴保溫45分鐘，冷卻測A。根據(jù)標準曲線和稀釋關系測的RNA的質(zhì)量。四.注意事項 樣品蛋白質(zhì)含量高時，應先用5三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)；有較多DNA樣品時也會發(fā)生干擾，可在試劑中加適量的CuCl2·H2O， 可減少DNA的干擾。五思考題鑒定中加入硝酸銀的目的是什么?實驗三氣相色譜法測定食用酒中乙醇含量（內(nèi)標法）一實驗目的1.了解氣相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)；2.學習和掌握使用氫火焰離子化檢測器的基本操作；3.掌握以內(nèi)標法進行色譜定量分析的方法及特點；4.學習氣相色譜法測定乙醇含量的分析方法。二、實驗原理 氣相色譜

10、法是一種高效、快速而靈敏的分離分析技術。 當液體樣品由進樣口注入后立即被汽化，并被載氣帶入色譜柱，經(jīng)過多次分配而得以分離的各個組分逐一流出色譜柱進入檢測器，隨時間變化而產(chǎn)生的電信號由記錄儀得到氣相色譜圖。對氣相色譜圖進行數(shù)學分析，即可對樣品進行定性定量分析。三、儀器與試劑 1.儀器：氣相色譜儀、氫火焰檢測器（FID）、色譜柱、微量注射器、容量瓶（10cm3）、色譜工作站、吸量管（2、5cm3）。 2.試劑：無水乙醇(A.R)、無水n-C3H7OH(A.R)、丙酮、食用酒。四、實驗步驟1. 色譜操作條件 柱溫：90；汽化室溫度：150；檢測器溫度：130；N2（載氣）流速：0.5cm3/min；

11、H2：5542 KPa；空氣：42 KPa； 2.標準溶液的測定 用吸量管準確吸取0.50cm3無水乙醇和0.50cm3無水n-C3H7OH于10cm3的容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.5L標準溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各色譜峰的保留時間tR和色譜峰面積，求出以無水n-C3H7OH為標準物的相對校正因子。3.樣品溶液的測定 用吸管吸取1.00cm3的食用酒樣品和0.50cm3的內(nèi)標物（無水n-C3H7OH）于10cm3容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻。用微量注射器吸取0.5L樣品溶液，注入色譜儀內(nèi)，記錄各色譜峰的保留時間tR，對照比較標準溶液與樣品溶液的tR，以確定樣品中的

12、醇，記錄 C2H5OH和n-C3H7OH色譜峰面積，求出樣品中C2H5OH的含量。 實驗四 生物傳感器的制作及其葡萄糖濃度的測定（探索性實驗）參考賈仕儒編的生物工程專業(yè)實驗244-248一 實驗目的了解生物傳感器的一般工作原理，掌握制作酶傳感器和使用其測定葡萄糖濃度的方法。二 實驗原理這時溶液中氧濃度的下降，相應的氧電極上的還原電流減少，通過電流值的變化可以確定葡萄糖的濃度。三 實驗設備與材料（1） 實驗設備及儀器電化學工作站、磁力攪拌器、pH計和超聲波清洗器（2） 實驗材料葡萄糖氧化酶(Sigma公司，2000u/g)，濃硫酸，丙酮，無水乙醇，葡萄糖（3），硝酸纖維素膜(規(guī)格: 1

13、5X20cm 孔徑: 0.45m  )，磷酸二氫鉀（0.1M），磷酸氫二納（0.1M）。四 實驗步驟三電極體系：酶膜修飾玻碳電極作工作電極，飽和甘汞電極( J6L) 為參比電極，鉑絲電極為對電極。（1） 工作電極的制作：玻碳電極（GC）依次用1.0 um a-氧化鋁粉； 0.3 um a-氧化鋁粉； 0.05 um g-氧化鋁粉及麂皮拋光至呈鏡面，再依次在水、無水乙醇和水中進行超聲清洗，于紅外燈下烘干備用。在0.5mL，0.1M磷酸緩沖液(pH 7，由磷酸二氫鉀（0.1M）和磷酸氫二納（0.1M）以1:2的體積比混合制成)中加入1mg葡萄糖氧化酶。溶解后加入一圓形，大小與玻碳電極的頂部尺寸相同為宜的硝酸纖維素膜進行酶的吸附半小時。用