FACSCalibur雙色熒光檢測(cè)簡(jiǎn)易操作步驟

1、FACSCalibur雙色熒光檢測(cè)簡(jiǎn)易操作步驟BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)易操作步驟1. 一、開機(jī)（見開機(jī)程序）開機(jī)1） 先打開凈化交流穩(wěn)壓電源，其次打開110V穩(wěn)壓輸出電源，再次打開流式細(xì)胞儀，最后打開計(jì)算機(jī)。在圖上用明顯顏色標(biāo)記出減壓閥位置2） 向前拉開儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減壓閥（紅色箭頭所示）方向調(diào)在VENT位置（箭頭方向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4左右，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN位置。二、開啟CellQuest 軟件、編輯實(shí)驗(yàn)文件1） 在蘋果菜單下點(diǎn)擊在屏幕下方點(diǎn)擊CELLQuest（第四個(gè)圖標(biāo)） 啟動(dòng)軟件。桌面會(huì)

2、出現(xiàn)一Untitled 實(shí)驗(yàn)文件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左右上角的放大鈕（紅綠色），將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2） 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框（當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時(shí)，會(huì)在其四角出現(xiàn)四個(gè)小黑塊）。3） 在出現(xiàn)的散點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊Plot Source，選擇Acquisition and Analysis (收取、分析) ，確認(rèn)X和Y軸參數(shù)預(yù)設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024。說明：散點(diǎn)圖（Dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中， 橫坐標(biāo)X軸橫坐標(biāo)X軸為為熒

3、光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)，縱坐標(biāo)Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。第一圖X和縱坐標(biāo)Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024；雙熒光標(biāo)記時(shí)，第二圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H 1024、FL2-H 1024，X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)， Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細(xì)胞大小，SSC：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。4）從屏

4、幕上方Plots菜單中選擇Dot Plot功能，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X軸：FL1-H 1024，； 如果是雙標(biāo)，Y軸選擇：FL2-H 1024(根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2來說明)，如果是單標(biāo)，Y軸選擇：SSC-H。點(diǎn)擊OK，F(xiàn)L1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成后可將重制圖移至原圖右方。說明：散點(diǎn)圖（Dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中， 橫坐標(biāo)X軸和縱坐標(biāo)Y軸參數(shù)分別設(shè)為FSC-H 1024、SSC-H 1024；雙熒光標(biāo)記時(shí)，第二圖X和Y軸參數(shù)分別設(shè)為FL1-H 1024、FL2-H

5、 1024，X軸為為熒光1強(qiáng)度的相對(duì)值，單位是道數(shù)， Y軸則通常表示熒光2或光散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因?qū)嶒?yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸參數(shù)，并依需要選擇之（FSC：細(xì)胞大小，SSC：細(xì)胞折射率，F(xiàn)L1：FITC綠色熒光，F(xiàn)L2：PE橙色熒光，F(xiàn)L3：PerCP紅色熒光）。5） 在工具板中選擇四象限工具，在FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng)Quadrant的中心將它設(shè)定在（x，y）（101，101）處，這些象限將指定陰性/陽性區(qū)域。6）從工具板中點(diǎn)擊直方圖圖示，在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。單色熒光只需一個(gè)直方圖，和第二個(gè)散點(diǎn)圖一樣，

6、橫坐標(biāo)選擇FL-1，縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts；若是雙色熒光，需畫2個(gè)直方圖，一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024，另一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-2-1024；7）在上面直方圖中畫出M1和M2，其中M1代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是101），M2代表陽性數(shù)目（除M1以外所有的部分）。8）從Stats菜單中選擇Quadrant Stats（象限統(tǒng)計(jì)）,5）步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。三、建立儀器和計(jì)算機(jī)之間通訊 從Acquire菜單中選擇Connect to Cytometer (快捷鍵Win+b)，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)Acquisition Control 對(duì)話方框。四、儀器設(shè)置文件注意：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定

7、文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrument settings），含信號(hào)器高壓（Detector/ Amps），閾值（Threshold），熒光補(bǔ)償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的順序?yàn)镈etector/Amps - Threshold - Compensation。1） 檢查現(xiàn)有儀器條件，從Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。出現(xiàn) Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口確認(rèn)FSC與SSC（根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品確定，一般細(xì)胞選擇LIN，細(xì)菌

8、選擇LOG），其它FL1-3為L(zhǎng)OG（對(duì)數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。2）從Cytometer菜單中選擇Threshold，出現(xiàn) Threshold 窗口在Threshold 窗口：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52。將其拖至空白區(qū)。3）從Cytometer菜單中選擇Compensation，確認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五、 上樣品、設(shè)置儀器使儀器處于High RUN，樣品管支撐架左移，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)Acquisition Control 窗口中ý Setup前需打叉或打勾 (即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)置)，點(diǎn)擊Acquire。 1、調(diào)節(jié)FSC/SS

9、C探測(cè)器（電壓）觀察FSC/SSC圖的變化。FSC電壓(Voltage)預(yù)設(shè)為E00，可調(diào)節(jié) Amp Gain 從1.009.99 使主要細(xì)胞群得以清楚顯示（如細(xì)胞較大，將FSC電壓設(shè)置于E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電壓使主要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause。2、Gating 圈選細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射（FSC）與側(cè)方散射（SSC）的二維位圖，即散射光圖譜（Sca

10、tter Plot），來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1） 在工具板中選擇多邊形的Region，在FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞R1 區(qū)域（如下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)域，您可以在工具列中點(diǎn)選Gates Region list ，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按Delete 鍵刪除R1 區(qū)域。刪除R1區(qū)域后，可用繪圖工具板，重畫R1。2） 選取希望Gate的FL1/FL2散點(diǎn)圖、FL1直方圖和FL2直方圖，從WindowsPlots菜單中選擇Show InspectorFo

11、rmat dot plot。在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)，將No Gate 改選 G1=R1。點(diǎn)擊OK。 3、調(diào)節(jié)FL1、FL2的探測(cè)器（電壓）1）點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓，使Negative Control細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100-101處。2）在Threshold 窗口，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾值>52，以去除碎片或低階噪音。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。 3）點(diǎn)擊Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，關(guān)閉Detector/Amps、

12、Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，不要再改動(dòng)Detector/Amps、Threshold等數(shù)值。4、調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭。（如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟）如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2（若3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的補(bǔ)償）。1） HighLow RUN，換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽性細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊­

13、;¯來選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pause。2） 移去單染CD3，換上單染CD19-PE管。點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Restart。調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pause。3.）最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Restart，確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成2色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊Acquisition Control窗口中的Pa

14、use、Abort。4）移去樣本管，換上ddH2O管，讓儀器暫且處于Standby狀態(tài)。關(guān)閉Compensation窗口。您已完成2色熒光之最適化。六、收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1）決定儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)為10000。如需修改，從Acquire菜單中選擇Acquisition & Storage，并在出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)Collection Criteria從10000 of All，再點(diǎn)擊OK。 2） 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D盤data盤中，按實(shí)驗(yàn)日期編排。從Acquire 菜單中選擇Parameter Description，出現(xiàn)Parameter Descri

15、ption對(duì)話方框。點(diǎn)擊Folder，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇Your Folder或新建活頁夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select Your Folder（一般用實(shí)驗(yàn)日期來命名Folder）。3） 命名即將儲(chǔ)存之文件名：點(diǎn)擊Parameter Description對(duì)話方框的File，出現(xiàn)文件名編輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實(shí)驗(yàn)來決定），點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK。4） Optional：如有需要，可選擇或在P1-P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。如P1：Size, P2：Granularity, P3：CD3 FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。5）計(jì)數(shù)器Counters：從Acquire

16、 菜單中選擇Counters. 窗口會(huì)顯示樣品分析速率、與總數(shù)進(jìn)度6）開始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。LOW RUN（根據(jù)Counters來調(diào)節(jié)速度，一般保持在700-800/Second），將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在Acquisition Control窗口中，將 ý Setup 改成 ¨ Setup，此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示 Your Folder文件名為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire” 便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。當(dāng)計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件文件名.001，并會(huì)以“嘟”聲告知，CellQuest會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成文件名.002。等待下一指示。7）

17、換上超純水，清洗管路，直到Counters持續(xù)顯示0/Second 30s (約為10-20s)，換上下一管樣品，點(diǎn)擊“Acquire” 啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。七、退出軟件并關(guān)機(jī)1）. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。2） 檢品分析完畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方 Acquire 指令欄中，選取Disconnect to Cytometer 以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“File”à“Quit”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“Dont save”)，進(jìn)行關(guān)