中國ALK陽性NSCLC診斷專家共識(shí)V14

1、2013 v1.0（草稿）（草稿）2 目的：目的：提高我國提高我國alk融合基因型肺癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療能力融合基因型肺癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療能力 （precision therapy）非小細(xì)胞肺癌的個(gè)體化靶向治療：非小細(xì)胞肺癌的個(gè)體化靶向治療：伴隨分子診斷是前提伴隨分子診斷是前提雖然雖然alk融合基因陽性患者僅占融合基因陽性患者僅占nsclc的的5%，但是，但是總體患者負(fù)荷較總體患者負(fù)荷較大，治療需求迫切大，治療需求迫切alk融合基因陽性融合基因陽性nsclc具有獨(dú)特臨床具有獨(dú)特臨床&病理、治療和預(yù)后特征，病理、治療和預(yù)后特征，已已成為成為nsclc中的一個(gè)分子亞型中的一個(gè)分子亞型第一個(gè)第

2、一個(gè)alk抑制劑克唑替尼已獲得抑制劑克唑替尼已獲得sfda的批準(zhǔn)（的批準(zhǔn)（2013.01）authoralk incidencepublicationszhang x, wu yl et al.11.6% (12/103)mol cancer 2009wong, et al. (hongkong)4.9% (13/265)cancer 2009li h, chen hq, et al.3.0% (7/230 smokers, ac)lung cancer 2012sun y, chen h, ji h, et al. 5.8% (3/52 surgical ac, non-smokers)jc

3、o 2010wu sg, yang pc, et al. (taiwan)34% (39/116, ac, wt egfr)jto 2012rikova k, et al4.7% (6/137)cell 2007wang z, wang j, et al.9.7% (11/113, stage iv )oncology 2012ren s, zhou c, et al.9.6% (10/104, female, ac, non-smoker)cell biochem biophys. 2012; cancer 2012glci internal data: 7% (70/977); 7.7%

4、(31/400)4 總體原則總體原則綜合肺癌獲取的各類生物材料的特征、分子分析方法的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室綜合肺癌獲取的各類生物材料的特征、分子分析方法的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件，需要多學(xué)科大協(xié)作，合理采取有效檢測(cè)方法和流程，自身?xiàng)l件，需要多學(xué)科大協(xié)作，合理采取有效檢測(cè)方法和流程，以保以保證證alk融合型肺癌的融合型肺癌的檢出率和準(zhǔn)確率檢出率和準(zhǔn)確率從臨床診斷角度出發(fā)，綜合最新的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合從臨床診斷角度出發(fā)，綜合最新的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合sfda批準(zhǔn)的伴隨批準(zhǔn)的伴隨診斷方法，診斷方法，定期更新定期更新，保證檢測(cè)結(jié)果的，保證檢測(cè)結(jié)果的可信性可信性和臨床實(shí)際和臨床實(shí)際可操作性可操作性5 alk+ can be

5、 enriched in clinical factors: age, histology, smoking status alk+ can be enriched in molecular subtypes: egfrwt, kraswt, and ac30% in caucasian pts(ac, egfr wt and kras wt)42% in chinese mailand pts (ac, egfr wt and kras wt)34% in taiwanese pts (ac egfrwt ) alk+ concomitant with egfr mutations: glc

6、i data: 1.3% (13/977) overally; in egfr mut pts, 3.9% (13/336) co-alteration rate; in alk+ pts, 18.6% (13/70) co-alteration rateeurtac data (2012 esmo by rosell): in egfrmut pts, 15.8% (15/95) co-alteration rateglci internal data;rosell, esmo 2012;horn, jco 2011 6nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)腺癌（粘液性

7、或?qū)嵭裕侔ㄕ骋盒曰驅(qū)嵭?，signet cell？）？）陰性或陰性或unknown下一步7組織標(biāo)本類型組織標(biāo)本類型 手術(shù)、活檢標(biāo)本：手術(shù)、活檢標(biāo)本： ffpe標(biāo)本：推薦fish、rt-pcr、ihc 新鮮標(biāo)本：推薦rt-pcr 細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：細(xì)胞學(xué)標(biāo)本： 細(xì)胞沉渣（pellet）：rt-pcr 細(xì)胞蠟塊（cell block）：推薦fish、rt-pcr、ihc 8nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)腺癌（粘液性或?qū)嵭?，腺癌（粘液性或?qū)嵭?，signet cell？）？）陰性或陰性或unknown據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)新鮮標(biāo)本石蠟標(biāo)本ventana ihc手動(dòng)手動(dòng)ihc檢

8、測(cè)檢測(cè)* ？陽性陽性陰性陰性fishrt-pcr多重多重pcr或或race*: 對(duì)于部分無條件行ventana ihc檢測(cè)的中心，手動(dòng)alk ihc可作為替代的篩選方法: 如果是細(xì)胞學(xué)樣本，推薦使用rt-pcr檢測(cè) 虛線：建議在富集人群（粘液性腺癌、含印戒細(xì)胞成分、不吸煙、年齡60歲）中進(jìn)行篩選3+/2+/1+alk融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌93-alk探針雜交端粒的斷點(diǎn)大約是300 kb，并用橘色熒光標(biāo)示。 5-alk探針雜交著絲粒的斷點(diǎn)大約是442 kb，并用綠色熒光標(biāo)示。 vysis alk break apart fish probe kit. 06n38-020

9、, 30-608495/r210橘紅色與綠色探針相互橘紅色與綠色探針相互臨近或粘合：臨近或粘合：alk 陰性陰性橘紅色與綠色探針相互分離或橘紅色與綠色探針相互分離或單個(gè)橘紅色探針：單個(gè)橘紅色探針：alk陽性陽性11 結(jié)果判讀需標(biāo)準(zhǔn)化，必需經(jīng)過培訓(xùn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀結(jié)果判讀需標(biāo)準(zhǔn)化，必需經(jīng)過培訓(xùn)的病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀 晚期患者小活檢標(biāo)本晚期患者小活檢標(biāo)本(2mm)，很難保證每個(gè)視野存在，很難保證每個(gè)視野存在50個(gè)癌個(gè)癌細(xì)胞細(xì)胞 價(jià)格昂貴，價(jià)格昂貴，2600元左右元左右/例，無法適用于篩選例，無法適用于篩選 目前，臨床研究的結(jié)果均是以目前，臨床研究的結(jié)果均是以fish為檢測(cè)手段為檢測(cè)手段12spl

10、it-signal fish:fusion-signal fish:translocation-positivetranslocation-negativefalse-positivefalse-negativemicroscope:sample/nucleus:slide:13 alk fish interpretaion criteria: 15% split signals, at least 50 tumor cells were analyzed, if the result is equivocal, additional 50 tumor cells should be coun

11、ted. positive cells: separated green and orange signals or single red signals identified cells with rearranged alk; negative cells: overlapping of orange and green signals (yellowish) indicated cells in which alk was not rearranged.martelli mp, sozzi g, hernandez l, et al. eml4-alk rearrangement in

12、non-small cell lung cancer and non-tumor lung tissues. am j pathol. 2009 feb;174(2):661-70shaw at, yeap by, mino-kenudson m, et al. clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harboreml4-alk. j clin oncol 2009;27:424753.the assay should be only on 10% neutral buffer

13、ed ffpe human lung tumor tissue. other types of specimens or fixatives should not be used. 14cancer, 2012crizotinib 臨床療效與臨床療效與alk+ 無關(guān)無關(guān):-alk+% 分離率并非療效就更好分離率并非療效就更好- alk+%分離率低并非療效不好分離率低并非療效不好15sun, jong-mu, et al.journal of thoracic oncology. 7(12):e36-e3816nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)腺癌（粘液性或?qū)嵭?，腺癌?/p>

14、粘液性或?qū)嵭?，signet cell？）？）陰性或陰性或unknown據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)新鮮標(biāo)本石蠟標(biāo)本ventana ihc手動(dòng)手動(dòng)ihc檢測(cè)檢測(cè)* ？陽性陽性陰性陰性fishrt-pcr多重多重pcr或或race*: 對(duì)于部分無條件行ventana ihc檢測(cè)的中心，手動(dòng)alk ihc可作為替代的篩選方法: 如果是細(xì)胞學(xué)樣本，推薦使用rt-pcr檢測(cè) 虛線：建議在富集人群（粘液性腺癌、含印戒細(xì)胞成分、不吸煙、年齡60歲）中進(jìn)行篩選3+/2+/1+alk融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌17在 alk融合陰性的患者，免疫組化顯示無alk表達(dá)。fish：進(jìn)行vysis lsi

15、 alk雙色打散fish探針檢測(cè)到alk融合（分裂的紅色和綠色信號(hào)）。 /10.1155/2013/757490 對(duì) amoydx eml4-alk融合基因檢測(cè)，實(shí)時(shí)rt-pcr顯示delta rn對(duì)pcr循環(huán)數(shù)的變化。在 alk融合陽性的患者，免疫組化顯示alk表達(dá)。18characteristicseml4-alkmutation, n (%)wild type, n (%)page, years 60 609 (3.6)19 (7.9)240 (96.4)220 (92.1)0.040sex male female9 (3.1)19 (9.8)286 (9

16、6.9)174 (90.2)0.002stage ia ib iia iib iiia iiib iv 12 (9.0)4 (2.9)2 (33.3)1 (2.3)9 (5.5)00122 (91.0)132 (97.1)4 (66.7)42 (97.7)156 (94.5)130.036bhistopathology ad scc ad-scce others25 (7.2)2 (2.0)1 ( 5.6)0324 (92.8)99 (98.0)17 (94.4)200.053ddifferentiation poor good unidentified8 (6.3)17 (5.0)3 (12

17、.5)119 (93.7)320 (95.0)21 (87.5)0.594smoking status no yes unknown21 (8.2)4 (2.6)3 (4.0)236 (91.8)152 (97.4)72 (96.0)0.021fprobaility of disease-free survival1.00.20.06.018.012.024.0time(months)logrank,p=0.006 alk positive alk negativej. x. zhou，et al. annals of oncology 00: 17, 2012 doi:10

18、.1093/annonc/mds62619 eml4-alk變異體的多種引物，變異體的多種引物，gapdh作為對(duì)照作為對(duì)照 glci內(nèi)部數(shù)據(jù)：所有內(nèi)部數(shù)據(jù)：所有12個(gè)個(gè)alk融合陽性樣品均通過多融合陽性樣品均通過多路路rt-pcr測(cè)序技術(shù)得以證實(shí)。測(cè)序技術(shù)得以證實(shí)。20takeuchi et al. multiplex reverse transcription-pcr screening for eml4-alk fusion transcripts. clin cancer res 2008;14(20): 6618zhang et al. molecular cancer 2010融合序

19、列捕獲融合序列捕獲的確定性的確定性21xc zhang，yl wu et al. 2012 esmo，22nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)腺癌（粘液性或?qū)嵭?，腺癌（粘液性或?qū)嵭裕瑂ignet cell？）？）陰性或陰性或unknown據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)新鮮標(biāo)本石蠟標(biāo)本ventana ihc手動(dòng)手動(dòng)ihc檢測(cè)檢測(cè)* ？陽性陽性陰性陰性fishrt-pcr多重多重pcr或或race*: 對(duì)于部分無條件行ventana ihc檢測(cè)的中心，手動(dòng)alk ihc可作為替代的篩選方法: 如果是細(xì)胞學(xué)樣本，推薦使用rt-pcr檢測(cè) 虛線：建議在富集人群（粘液性腺癌、含印戒細(xì)胞成

20、分、不吸煙、年齡5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)顆的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)顆粒狀細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)著色；粒狀細(xì)胞質(zhì)強(qiáng)著色；ihc 2+：5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中度細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)中度細(xì)胞質(zhì)著色；質(zhì)著色；ihc 1+：5%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的細(xì)胞質(zhì)的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或模糊的細(xì)胞質(zhì)著色或著色或5%的腫瘤細(xì)胞有任何程度的著色；的腫瘤細(xì)胞有任何程度的著色；ihc 0：腫瘤細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞無著色。無著色。”e thunissen, et al. virchows arch(2012)461:245-25731yoshiko murakami, et al. frontiers in oncology .2012;doi: 10.338

21、9/fonc.2012.00024 32thunnissen e, et al. virchows arch . 2012;461:245257 33nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)腺癌（粘液性或?qū)嵭?，腺癌（粘液性或?qū)嵭裕瑂ignet cell？）？）陰性或陰性或unknown據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)新鮮標(biāo)本石蠟標(biāo)本ventana ihc手動(dòng)手動(dòng)ihc檢測(cè)檢測(cè)* ？陽性陽性陰性陰性fishrt-pcr多重多重pcr或或race*: 對(duì)于部分無條件行ventana ihc檢測(cè)的中心，手動(dòng)alk ihc可作為替代的篩選方法: 如果是細(xì)胞學(xué)樣本，推薦使用rt-pcr檢測(cè) 虛

22、線：建議在富集人群（粘液性腺癌、含印戒細(xì)胞成分、不吸煙、年齡60歲）中進(jìn)行篩選3+/2+/1+alk融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌融合基因陽性非小細(xì)胞肺癌34alk融合蛋白融合蛋白: 無alk重排的nsclc不表達(dá)alk融合蛋白 部分alk融合蛋白表達(dá)較低ventana ihc的原理的原理: 使用具有高度敏感性和特異性的一抗d5f3 全自動(dòng)儀操作，充分保證特異性 獨(dú)有optiview擴(kuò)增技術(shù)，充分保證敏感性d5f3 rabbitt monoclonal antibodyoptiview dab ihc detectionoptiview amplification kit3535全自動(dòng)全自動(dòng)vent

23、ana ihc：信號(hào)擴(kuò)增：信號(hào)擴(kuò)增常規(guī)常規(guī)ihc：無信號(hào)擴(kuò)增：無信號(hào)擴(kuò)增d5f3 rabbit mabcontrol rabbit mabalk-positive nsclc by vysis fish and ventana alk ihc36d5f3 rabbit mabcontrol rabbit mabalk-positive nsclc by vysis fish and ventana alk ihcd5f3 rabbit mabcontrol rabbit mablarge majority of positive cases exhibit strong staining.37

24、37 判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單，僅存在陰性判讀標(biāo)準(zhǔn)簡單，僅存在陰性 or 陽性的判讀陽性的判讀 ihc 陽性陽性 = fish 陽性陽性ec minca, et al. j mol diag, 201338ventana. 1011623en rev c.2012; ft0700-410f 臨床解釋臨床解釋染色說明染色說明alk陽性陽性腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在強(qiáng)顆粒狀染色腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在強(qiáng)顆粒狀染色（任何陽性腫瘤細(xì)胞的百分比），（任何陽性腫瘤細(xì)胞的百分比），已已知的假陽性染色要排除，包括：知的假陽性染色要排除，包括：光鏡下肺泡巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)斑點(diǎn)光鏡下肺泡巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)斑點(diǎn)神經(jīng)源性細(xì)胞（神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）神

25、經(jīng)源性細(xì)胞（神經(jīng)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）腺上皮細(xì)胞染色腺上皮細(xì)胞染色腺上皮細(xì)胞胞內(nèi)淋巴侵潤腺上皮細(xì)胞胞內(nèi)淋巴侵潤nsclc患者的正常粘膜組織和壞死腫患者的正常粘膜組織和壞死腫瘤組織有時(shí)也能見到染色顆粒（包括瘤組織有時(shí)也能見到染色顆粒（包括粘液素），這些都應(yīng)該排除在外粘液素），這些都應(yīng)該排除在外alk陰性陰性腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中無強(qiáng)顆粒狀染色腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中無強(qiáng)顆粒狀染色ihc 陽性陽性=fish陽性陽性ihc 陰性陰性=fish陰性陰性3939 全自動(dòng)檢測(cè)，避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好全自動(dòng)檢測(cè)，避免操作流程中的誤差，可重復(fù)性好4040 價(jià)格便宜，可同時(shí)用于價(jià)格便宜，可同時(shí)用于alk的篩選和診斷的篩選和

26、診斷 emea（歐盟）批準(zhǔn)（歐盟）批準(zhǔn)ventana ihc用于診斷用于診斷alk陽性陽性nsclc，從而，從而幫助確定可使用克唑替幫助確定可使用克唑替尼的患者尼的患者中國患者檢測(cè)價(jià)格中國患者檢測(cè)價(jià)格預(yù)估預(yù)估250元元/例例41nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)陰性或陰性或unkown是否必須在富集是否必須在富集人群中檢測(cè)人群中檢測(cè)alk？下一步42 egfr與與alk雙突變的存在：雙突變的存在：5%-8% eurtac研究中：雙突變概率研究中：雙突變概率15.8%（rt-pcr法）法） 有文獻(xiàn)報(bào)道，雙突變患者克唑替尼治療有效有文獻(xiàn)報(bào)道，雙突變患者克唑替尼治療有效43

27、 如果按照臨床因素富集，將漏診如果按照臨床因素富集，將漏診33%（2/6）的的alk陽性患者陽性患者yoshiko murakami, et al. frontiers in oncology .2012;doi: 10.3389/fonc.2012.00024 44 如按病理因素富集：可能會(huì)遺漏如按病理因素富集：可能會(huì)遺漏30%(5/17)的的alk陽性患者陽性患者45nsclc 活檢組織標(biāo)本活檢組織標(biāo)本egfr突變檢測(cè)突變檢測(cè)陰性或陰性或unknown據(jù)組織類型選擇合適技術(shù)新鮮標(biāo)本石蠟標(biāo)本ventana ihc手動(dòng)手動(dòng)ihc檢測(cè)檢測(cè)* 陽性陽性陰性陰性fishrt-pcr多重多重pcr或或race*: 對(duì)于部分無條件行ventana ihc檢測(cè)的中心，手動(dòng)alk ihc可作為替代的篩選方法: 如果是細(xì)胞