大創(chuàng)實驗初步方案

1、大創(chuàng)實驗初步方案 乙醛脫氫酶( ALDH) 是一類依賴于NAD( P) +的酶類，負(fù)責(zé)催化生物體內(nèi)各種醛類轉(zhuǎn)化為對應(yīng)羧酸，該類蛋白質(zhì)都含谷氨酸、半胱氨酸活性位點，根據(jù)蛋白質(zhì)具體序列差異，生物中至今發(fā)現(xiàn)有22 個不同家族，其中植物13 個，不同家族酶類除了乙醛、丙二醛等通用底物以外，還有各自特異性底物，行使多方面的生物學(xué)功能。ALDH7 是乙醛脫氫酶家族中一類尤其保守的蛋白質(zhì)，甚至在動植物之間也有高度的序列同源性，所以又被稱為遺蛋白質(zhì)( Antiquitin) 。人類ALDH7基因研究得比較透徹，確認(rèn)在賴氨酸降解途徑中負(fù)責(zé)-氨基己二酸半醛( AASA) 的催化，所以該酶又被稱為-氨基己二酸半醛脫

2、氫酶。植物中ALDH7 基因表達(dá)受到高鹽、干旱等滲透脅迫的誘導(dǎo)，源于ALDH7 可以及時清除逆境中產(chǎn)生的有害醛類抵御活性氧( ROS) 的產(chǎn)生。擬南芥、水稻中過量表達(dá)自身ALDH7 可以顯著提高植株對逆境的耐性，提高抗氧化能力7; 擬南芥、煙草中過量表達(dá)大豆ALDH7，也可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫能力，這些研究進(jìn)一步反映出該基因 巨菌草屬于禾本科狼尾草屬植物，主要分布在非洲北部地區(qū)，1983 年由福建農(nóng)林大學(xué)林占嬉研究員引進(jìn)中國，經(jīng)過30 多年的培育，已經(jīng)成為一種適合我國南方氣候土壤環(huán)境的草種。巨菌草適宜在25 35 下生長，植株高大，直立叢生，產(chǎn)量高，糖及粗蛋白質(zhì)含量高，抗逆性較強，既可作

3、培養(yǎng)料栽培食( 藥) 用菌，又可用于制作畜禽飼料，還可以用于水土保持、生物燃料、生物材料等領(lǐng)域的研究。巨菌草作為一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌草，有很高的利用價值，值得推廣，但其生長需要高溫和濕潤的土壤條件，而我國南方經(jīng)常出現(xiàn)的不定期干旱不但降低了它的生產(chǎn)效益，同時也限制了它的進(jìn)一步推廣，因此需要對巨菌草的抗旱性進(jìn)行一些基礎(chǔ)性的研究。巨菌草育種及誘導(dǎo)處理1.育種 本實驗采用的是巨菌草種子（）。試驗于2016年 月 日至 月日在延安大學(xué)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室內(nèi)完成。育種過程為: 共準(zhǔn)備40 個規(guī)格一致的圓形塑料盆，每盆盛有2 kg 土質(zhì)一樣的土，澆足充足的水份。每盆播撒十到十五顆種子，種植深度約三到四厘米，待全

4、部長出芽后，選出芽長勢較一致的21 盆隨機分成3 組進(jìn)行處理。在脅迫處理前每盆每天澆水至土壤保持濕潤而土表沒有積水。2.干旱誘導(dǎo)在脅迫處理前每盆每天澆水1 L，使土壤保持濕潤而土表沒有積水。長到2 周后，第7 組巨菌草停止供水由其蒸騰作用開始進(jìn)行自然干旱，脅迫天數(shù)為6 d; 1 d 后，第6 組巨菌草停止供水開始自然干旱，脅迫天數(shù)為5 d; 以此類推，直到第2 組巨菌草開始干旱脅迫，以此形成一個干旱脅迫梯度。第1 組巨菌草每天保持原有澆水量不變作為對照，脅迫天數(shù)為0 d。每個處理4 盆。2.1 取樣方法脅迫完成后取巨菌草幼苗頂端相同葉位的幼葉作為材料，剪碎葉片混勻，稱取一定質(zhì)量冷藏于 80 保

5、存?zhèn)溆谩?.2 測定指標(biāo)及方法土壤含水量的測定采用烘干法，葉片的含水量和相對含水量測定采用飽和稱重法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G 250 染色法，游離氨基酸含量的測定采用茚三酮顯色法，脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸法。每個指標(biāo)重復(fù)測定3 次。3.結(jié)果及分析3.1干旱脅迫下土壤含水量的變化 3.2干旱脅迫時間與葉片含水量關(guān)系3.3干旱時間與葉片相對含水量關(guān)系3.4干旱脅迫時間與可溶性蛋白含量關(guān)系3.5干旱脅迫時間與游離氨基酸含量關(guān)系3.6干旱脅迫時間與脯氨酸含量關(guān)系巨菌草RNA提取由于RNA分子的結(jié)構(gòu)特點，容易受RNA酶的攻擊反應(yīng)而降解，加上RNA酶極為穩(wěn)定且廣泛存在，因而在提取過程中

6、要嚴(yán)格防止RNA酶的污染，并設(shè)法抑制其活性，這是本實驗成敗的關(guān)鍵。所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經(jīng)常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑，它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物，因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度，然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌

7、以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞RNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外，也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復(fù)合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經(jīng)硅烷化處理。常采用的蛋白質(zhì)變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉（SDS）等。為防止外源Rnase的污染，所有試驗用品均需用DEPC處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經(jīng)DEPC處理過的水

8、或滅菌處理。內(nèi)源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強還原劑。實驗步驟 ：（CTAB法）（1）65°C水浴中預(yù)熱15 mL CTAB提取液。（2）液氮中研磨23 g新鮮材料。（3）轉(zhuǎn)移樣品至有CTAB提取液的離心管中，立即激烈渦旋30s，短時放回 65°C水浴中（45 min）。（4）加入等體積的氯仿/異戊醇并渦旋混合，10000 rpm常溫離心15 min。（5）將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管。重復(fù)抽提一次。（6）將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的終濃度為2 mol·L-1，即加入1/3體積的LiCl，4°C下沉淀過夜（最多16

9、h）。（7）4°C離心1 h(全速)，棄上清，用500 L70%乙醇洗沉淀，然后用500 L100% 乙醇洗沉淀。（8）用500 L SSTE 溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇抽提一次。（9）加入2×體積的無水乙醇，在-70°C沉淀30 min或-20°C沉淀2 h。（10）4°C離心20 min沉淀RNA（全速）。（11）先用400 L70%乙醇洗沉淀，然后用400 L100% 乙醇洗沉淀，吹干后用65 LDEPC水溶解RNA。用Trizol試劑盒提取菌草總RNA效果也良好。電泳檢測RNA：（1）配制1.2%的瓊

10、脂糖凝膠（20mL）稱取瓊脂糖0.24 g，加DEPC處理的ddH2O 12.04 mL，5×RNA 電泳緩沖液4 mL，電爐加熱融化瓊脂糖，冷卻至55°C，加入甲醛1.96 mL，冷卻后倒膠。（2）RNA電泳取去離子甲酰胺10 L，甲醛1.5 L，10× RNA Buffer 2 L，RNA (24 g, <10 L) 混合液，65°C加熱15min，迅速在冰浴中冷卻片刻，然后加入3 L RNA 加樣緩沖液和0.5 L EB，上樣電泳。電泳Buffer 為1× RNA buffer。出現(xiàn)的電泳條帶有兩條，是兩條最大的核糖體RN

11、A（rRNA）分子，即18S 和28S rRNA，較小的RNA也很豐富但看不到，因為太小，跑出了凝膠的邊界。多數(shù)細(xì)胞中的信使RNA（mRNA）經(jīng)EB染色后不足以形成可見的帶。只要18S 和28S rRNA帶亮，且28S rRNA大約為18S rRNA 的兩倍，說明提取的RNA沒有發(fā)生降解，純度好。菌草ALDH7基因引物設(shè)計問題最嚴(yán)重1 1 花生EST 搜索與拼接 利用NCBI 的tblastn 程序( http: / /blast ncbi nlm nih gov /)，以水稻、擬南芥ALDH7 蛋白質(zhì)序列( Os09g0440300 與AT1G54100) 作為檢索源，檢索花生EST 數(shù)據(jù)庫

12、( 截止2013 年5 月有246 733 條) 。下載所有同源性大于60% 的EST 序列，利用SeqMan( DNA Star) 進(jìn)行拼接，得到較大片段的長序列，對長序列進(jìn)行ORF 分析( ORF Finder，http: / /www ncbi nlm nih gov /projects /gorf / ) 與保守結(jié)構(gòu)域分析( Conserved Domain Database，http: / /wwwncbi nlm nih gov /Structure /cdd /wrpsb cgi) ，基于該ORF 序列設(shè)計全長與表達(dá)相關(guān)引物。1 2基因全長的獲得、蛋白質(zhì)翻譯、序列同源性與進(jìn)化樹分

13、析以總cDNA 為模板，進(jìn)行基因全長擴(kuò)增( TaKaRa Primestar) 。PCR 程序為: 98 5 min; 98 10 s，55 10 s，72 2 min 進(jìn)行35 個循環(huán); 72 10 min。擴(kuò)增出的cDNA 進(jìn)行測序確認(rèn)。利用EditSeq( DNA Star) 對序列進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，其他生物ALDH7 蛋白質(zhì)序列在NCBI 下載。各序列利用Cluster X2 1 進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 5 10 進(jìn)行進(jìn)化樹分析，設(shè)置都采取軟件默認(rèn)參數(shù)。1 3RT-PCR擴(kuò)增目的基因cDNA的合成：逆轉(zhuǎn)錄體系的組成：DEPC處理水 8ul10mMdNTPs 2.5ulRandom&

14、#160;primers 0.4ulRNasin  0.5ul總RNA  2.53ug70 5min速置冰水中冷卻再加 : 5*逆轉(zhuǎn)錄buffer 5ul逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 1ul(200U)加水至25ul37 60min90 5min或者用Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒操作得到cDNAPCR反應(yīng)體系 50ul PCR體系的組成：10× PCRbuffer 5ulMgCl2 3ul(2.0mM)10mMdNTPs 1ulsense primer  1ul(1umol/l)antisense

15、60;primer  1ul(1umol/l)cDNA  1.5ulDEPC處理水 36.7ulTaq 酶 0.8ul(2.4U)總體積 50ul PCR反應(yīng)條件：98 5min98 10sec55 10sec 72 2min  35 cycles72 10min目的基因與T載體相連1.1將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后回收PCR產(chǎn)物切膠回收 (1)、在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠計算凝膠重量。100mg凝膠,計100ul體積,盡量縮短暴露UV燈下的時間. (2)、加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,600 ul混合均勻

16、后于65°C 加熱,直至凝膠完全熔化。 (3)、加0.5個Buffer DE-A 體積的Buffer DE-B,300 ul,混合均勻;當(dāng)分離的DNA片段小于400 bp時加入1個凝膠體積的異丙醇。 (4)、吸取3中的混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管置于2 ml 離心管中,12000× g 離心1 min。棄濾液。 (5)、將制備管置回2 ml離心管中加500 ul Buffer W1, 12000× g 離心30 sec,棄濾液。 (6)、將制備管置回2 ml離心管中,加700 ul Buffer W2, 12000× g 離心30 sec,棄濾液。重復(fù)一次。

17、 (7)、將制備管置回2 ml離心管中, 12000× g 離心1 min。徹底去除殘余的液體。 (8)、將制備管置于1.5 ml離心管中在制備膜中央加25-30 ul 65°C Eluent或去離子水室溫靜置1 min。 12000× g 離心1 min洗脫DNA。 1.2回收產(chǎn)物與T載體相連 將回收產(chǎn)物與T載體在T4DNA連接酶下4連接過夜 重組子的轉(zhuǎn)化與篩選 1.1將連接好的重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5，感受態(tài)細(xì)胞制備： 1)挑取-20保存的DH5單菌落接種于3ml的LB液體培養(yǎng)基中，37160r/min培養(yǎng)過夜（此為一級培養(yǎng)）2)將一級培養(yǎng)菌液接2%的量接種于

18、5ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37，200r/min,培養(yǎng)2.53.0h，使細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期。（OD600=0.6左右）3)將二級培養(yǎng)產(chǎn)物分裝到1.5ml離心管，冰浴30min.4). 4000r/min離心10min,棄上清。5)加750ul0.1mol/l冷CaCL2液懸浮菌體。6)4000r/min，棄上清，加入80ul預(yù)冷的CaCL2（0.1mol/l）重懸菌體。7). 制備好的感受態(tài)冰浴過夜成直接用于轉(zhuǎn)化或加無菌甘油（1520%）70長期保存1.2通過藍(lán)白班篩選得到陽性克隆：-互補 的原理 載體上帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5菌株帶有-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下, 載體和DH5編碼的-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在二者融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象叫-互補。 藍(lán)白斑篩選的機理 由-互補產(chǎn)生的Lac+ 細(xì)菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外