RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR

1、RT-PCR及及實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)原理技術(shù)原理 定義：定義： PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction)，是通過(guò)模擬體內(nèi)，是通過(guò)模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的復(fù)制的 方式，在體外選擇性地將方式，在體外選擇性地將 DNA 某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò) 增出來(lái)的技術(shù)。增出來(lái)的技術(shù)。n PCR技術(shù)技術(shù):PCR概念的提出概念的提出n1983，Kary Mullis引物引物引物引物Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高溫。Heat-stable polymerase is vital

2、to the ease of the processthermus aquaticusTaq DNA多聚酶的發(fā)現(xiàn)多聚酶的發(fā)現(xiàn)1988年年Saiki 等從溫泉等從溫泉（ Hot spring）中分離）中分離的一株水生嗜熱桿菌的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱DNA聚合酶。聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)此酶具有以下特點(diǎn)： 耐高溫，耐高溫， 在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。新酶。 大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)度(2

3、.0Kb)。 酶命名為酶命名為T(mén)aq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。廣泛應(yīng)用。 在在 1989 年，年，Science 將將PCR中的中的Taq DNA多聚酶命多聚酶命 名為當(dāng)年的風(fēng)云分子名為當(dāng)年的風(fēng)云分子 (Molecule of the year) 722.PCR反應(yīng)過(guò)程：反應(yīng)過(guò)程： 模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈DNA 引物：引物：16-30 bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐熱的聚合酶：耐熱的DNA聚合酶聚合酶 底物：四種脫氧三磷酸核苷底物：四種脫氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP

4、、dCTP、dGTP) 3.PCR基本要素基本要素4.PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序9496 30-3 預(yù)變性（使模板預(yù)變性（使模板DNA充分變性）充分變性）94 30 變性變性50-60 30-1 復(fù)性（使引物與模板充分退火）復(fù)性（使引物與模板充分退火）72 n(按按1擴(kuò)增擴(kuò)增1kb計(jì)算）延伸計(jì)算）延伸 72 3-7 總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）4-10 保存保存 25-35個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)1）復(fù)性和延伸復(fù)性和延伸溫度溫度 復(fù)性的溫度是復(fù)性的溫度是 PCR 擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在 50-60 之間。具體的溫度主要由引物的之間。具體的溫度主要由

5、引物的 Tm 值決定值決定（低于（低于Tm 值值2-3 ）。）。 延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72 。如果復(fù)性的溫度很高，。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法法 PCR 。2）反應(yīng)）反應(yīng)時(shí)間時(shí)間 變性一般使用變性一般使用 30 秒鐘，如果模板的秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。 復(fù)性時(shí)間有復(fù)性時(shí)間有 30 秒種一般是足夠的。秒種一般是足夠的。 延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大

6、小決定，一般采用 1kb 用用 1 分分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。 3）循環(huán)）循環(huán)次數(shù)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為 2535 次。次。 平臺(tái)效應(yīng)（平臺(tái)效應(yīng)（plateau effect）：）：PCR 擴(kuò)增過(guò)程后期出現(xiàn)擴(kuò)增過(guò)程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。 原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP 和和 DNA 聚合聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低酶的穩(wěn)定性或活性降低 ，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用

7、，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底。徹底。 引物設(shè)計(jì)的一般原則引物設(shè)計(jì)的一般原則 長(zhǎng)度：至少長(zhǎng)度：至少 16bp ，通常為，通常為 18-30bp。 更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。 引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的 Tm 值差異最好在值差異最好在 2-5 。 對(duì)于小于對(duì)于小于 20 個(gè)堿基的引物其個(gè)堿基的引物其 Tm 值可用簡(jiǎn)易公式計(jì)

8、算，即值可用簡(jiǎn)易公式計(jì)算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。）。 對(duì)于對(duì)于 14-70 個(gè)核苷酸的引物可用個(gè)核苷酸的引物可用 以下公式計(jì)算。以下公式計(jì)算。 Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N） N 表示引物的核苷酸數(shù)目，表示引物的核苷酸數(shù)目， K+ 表示單價(jià)離子即鉀離子的濃度表示單價(jià)離子即鉀離子的濃度 避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的 3端）。端）。 G+C 含量：盡量控制在含量：盡量控制在 40% 至至 60% 之間，之間， 4 種堿基的分布應(yīng)種堿基的分布應(yīng) 盡可能均勻。盡量避免嘌呤

9、或嘧啶的連續(xù)排列，以及盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及 T 在在 3 末末 端的重復(fù)排列。端的重復(fù)排列。 引物的引物的 3 末端最好是末端最好是 G 或或 C ，但不要，但不要 GC 連排。連排。2、反轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄PCR RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又稱反轉(zhuǎn)錄又稱反轉(zhuǎn)錄PCR, 是以反轉(zhuǎn)錄的是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA作模板所進(jìn)行的作模板所進(jìn)行的PCR， 可對(duì)基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析?？蓪?duì)基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析。聚合酶聚合酶cDNAPCR擴(kuò)增AAAnAAAAnA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 T T TnTcDNA第一鏈第一鏈m

10、RNA3.實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR( real-time PCR)常規(guī)常規(guī)PCR技術(shù)：技術(shù)：對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析進(jìn)行定量及定性分析定量定量PCR技術(shù)：技術(shù)：對(duì)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析進(jìn)行定量及定性分析（1）原理：）原理： 通過(guò)特定設(shè)計(jì)的通過(guò)特定設(shè)計(jì)的PCR儀器來(lái)儀器來(lái)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)擴(kuò)增過(guò)程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量增過(guò)程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好，可以很好的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實(shí)時(shí)的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實(shí)時(shí)定量定量PCR。域值域值：將熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)：將熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的應(yīng)的熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度設(shè)定為域值。設(shè)定為域值。Ct值值：熒光信號(hào)達(dá)到域值