最新電鏡目前的技術難點及未來發(fā)展趨勢

1、5冷凍電鏡目前的技術難點及未來發(fā)展趨勢與其他的結構生物學和生物物理學研究方法類似，冷凍電子顯微學在硬件設備上的長足進展解決了很多關鍵性的技術難點，使該方法的應用普及成為趨勢。同時，一些其他的技術難點凸顯出來，成為結構解析中的瓶頸，需要更多的關注與投入。5.1 樣品制備技術樣品制備一直是冷凍電子顯微學研究的關鍵步驟。對于生物大分子結構研究來說，需要保證單顆粒分子以合適的密度均勻分布于厚度合適的無序冰中，才有可能獲得良好的電子顯微數(shù)據(jù)進行結構解析。由于不同的生物大分子與樣品支持膜的相互作用及在水溶液中的性質(zhì) 各不相同，分子在樣品中的分布狀態(tài)各異。目前普遍采用的冷凍制樣技術在基本原理上仍然采用30年

2、前發(fā)明的方法，實驗可重復性、操作可移植性、通用性等都很差。樣品制備已經(jīng) 成為冷凍電子顯微學結構解析的限速步驟。冷凍電子顯微學要想成為結構生物學研究的主要應用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似的，對于細胞結構研究來說，將 本身很厚的細胞樣品進行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。 在過去的十多年里， 冷凍切片技術一直在穩(wěn)步發(fā)展，至今已經(jīng)成為相對成熟的技術，但是對該技術的熟練掌握仍然需要長期的培訓與實踐經(jīng)驗。最近發(fā)展起來的聚焦離子束減薄技術在未來可能會對冷凍細胞樣品的結 構研究帶來新的契機。5.2 高分辨率結構的分析與建模應用冷凍電子顯微學技術在過去的兩年里所獲得的近原子分辨率（4?以上）

3、三維結構的數(shù)目幾乎超過了前面幾十年所獲得的高分辨率結構數(shù)目之和。更多的在48?分辨率范圍內(nèi)的結構在很短時間內(nèi)被解析出來，不同的分辨率結構可以揭示出的結構細節(jié)亦不同。而與晶體學手段不同，冷凍電子顯微學單顆粒重構無法通過對晶格衍射點的信號強弱來判斷分辨 率。因此，如何客觀地對三維重構的結果進行檢驗、明確結構解析的分辨率是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的一個重要問題。在此基礎上，需要對不同分辨率水平的三維重構進行原子模型的構建，從而實現(xiàn)在原子水平上對分子功能的解釋。對于分辨率在 4?以上的三維重構 基本可以應用X射線晶體學現(xiàn)有的方法進行建模；對分辨率在4?以下的三維結構如何建立 較為可信的模型，則仍缺少

4、相對成熟并被普遍接受的方法。一些研究組正在利用同源建模、 分子動力學模擬等手段來進行這一分辨率水平的原子模型搭建的嘗試。5.3 生物大分子構象不均一性的分析冷凍電子顯微學單顆粒結構解析技術與晶體學技術的一個重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結構。但生物大分子尤其是大分子復合體本身的構象柔性亦因此沒有被固定在晶體結構中，這些構象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導致三維重構無法獲得高分辨率結構的根源。將不同構象的分子分開分析，是提高重構分辨率的重要過程。此外，分子在溶液中的不同構象很可能反映了分子發(fā)揮功能的不同結構形態(tài)，理解這些構象差異對于

5、解釋分子功能的機制非常重要。目前對生物大分子構象不均一性的分析是冷凍電子顯微學結構解析中的技術難點和熱點?，F(xiàn)有的一些算法通過聚類分析、最大似然法分析等對某些生物大分子復合物的結構解析取得了重 要的發(fā)現(xiàn)，但對這個問題的解決需要更多的新思路和新算法。5.4 電子光學新技術方法在生物樣品研究中的應用材料科學超高分辨率研究在過去十幾年里也發(fā)生了很多重要的技術進步，主要是電子顯微鏡光學系統(tǒng)的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進步，新的技術諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統(tǒng)等都在材料科學領域結構分辨率的顯著提高中發(fā)揮了重要作 用。目前，利用最新的電子光學成像系統(tǒng)，物理學和材料科學研究者已經(jīng)可以

6、獲得0.5?的分辨率。隨著對生物樣品近原子分辨率結構解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學發(fā)展的下一個目標。如何應用材料科學領域證明對超高分辨成像卓有成效的電子顯微學方法來提高生物樣品的結構解析分辨率，是擺在所有冷凍電子顯微學家面前的新機遇和挑戰(zhàn)。此外，新的技術如電子顯微鏡相位板(phase-plate)的開發(fā)與應用已經(jīng)被證明對于利用單顆粒技術解析小分子量的蛋白質(zhì)結構以及利用電子斷層掃描三維重構技術研究細 胞結構具有重大的促進作用。該項技術很可能在未來幾年里引起冷凍電子顯微學的另一次新 的重大突破。5.5 體內(nèi)結構的研究自從上世紀中期建立以來，結構生物學主要是通過對分離純化至體

7、外的生物大分子結構 進行解析。至今解析出來的多達10萬的生物大分子結構對于我們理解生物學過程的分子機制發(fā)揮了重要的作用。但迄今為止，我們?nèi)詿o法通過直接觀察獲得細胞內(nèi)乃至體內(nèi)的生物大 分子的原子分辨率結構。冷凍電子顯微學尤其是三維斷層掃描重構的發(fā)展給我們提供了這樣 的契機。通過更穩(wěn)定的電子顯微鏡系統(tǒng)、更高效的數(shù)據(jù)采集裝置、更強大的計算機處理工具， 三維斷層掃描重構將有可能幫助我們對細胞內(nèi)的特定分子結構進行重構和統(tǒng)計分析，從而獲得它們的高分辨率結構。如何對細胞中特定分子的標定則是目前冷凍電子顯微學細胞結構研 究面臨的一個主要技術問題。如果能實現(xiàn)以上目標，冷凍電子顯微學將可能真正填補結構生 物學與細

8、胞生物學之間的空隙，使得我們從不同空間與時間尺度上對生物體的理解更加完 整。6個人感悟與結論縱觀整個冷凍電鏡的工作流程，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡的基本工作原理其實不難以理解，但整個冷凍電鏡的結構非常的龐大與復雜，目前可以生產(chǎn)并且銷售這種昂貴的冷凍電鏡的公司也只有美國FEI等少數(shù)幾家專業(yè)的顯微鏡制造公司，顯然目前我國還并沒有掌握這種高精尖儀器的生產(chǎn)制造技術，我國整體的科學儀器制造水平與美國等西方發(fā)達國家相比仍然是存在 較大的差距。結合儀器專業(yè)的角度來看冷凍電鏡的結構，我們發(fā)現(xiàn)冷凍電鏡技術其實在很多方面與我們儀器專業(yè)密切相關，比如說冷凍電鏡的一大優(yōu)點就是樣品臺穩(wěn)定，普通的電鏡穩(wěn)定工作臺需要10分鐘，而最好

9、的冷凍電鏡工作臺的穩(wěn)定時間已經(jīng)可以實現(xiàn)在20秒左右，效率至少是普通電鏡的30倍，如何設計這樣一種需要很快時間穩(wěn)定下來且精度要求很高的工作臺就是 我們儀器專業(yè)領域所要研究的問題，我們可以遵循粗精結合、基面合一、變形最小等基本的儀器設計原則對工作臺進行設計，在設計的過程當中可以借助計算機軟件進行仿真，例如我們可以利用ANSYS軟件，運用有限元的思想仿真工作臺在受力情況下的變形程度以及計算 工作臺受外界擾動后再次達到穩(wěn)定所需的時間，優(yōu)化設計工作臺的設計參數(shù)。而對于冷凍電鏡自動換樣品、自動換氮、自動維持清潔功能的實現(xiàn)，結合我們儀器專業(yè)分析，自動化功能 的實現(xiàn)首先是需要設計一系列的傳動、運動系統(tǒng)，有了傳

10、動、運動系統(tǒng)的配合，儀器才可能完成一系列把樣品自動送出、送入，自動維持自身清潔等智能化的動作，如何設計出這樣一整套既能夠?qū)崿F(xiàn)預期的功能，又要保證整個儀器的工作可靠性的系統(tǒng)，是我們在儀器設計的時候需要認真去考慮的問題。 光學系統(tǒng)設計同樣也是儀器設計當中一個重要的技術難點，對這些復雜、龐大的顯微儀器而言， 光學系統(tǒng)的設計就顯得尤為重要。顯微儀器設計的目的就是為了幫助人們更好地去認識微觀世界，判斷顯微儀器的好壞最直接的方法就是看其成像的質(zhì)量，成像是否清晰，是否可以突破衍射極限，達到原子分辨率量級，而這又與光學有著直接的聯(lián)系。我們在設計儀器光路系統(tǒng)的時候，如何能夠?qū)崿F(xiàn)光路的最優(yōu)化，如何可以消除球差、慧

11、差、像差、畸變、色散等一系列的像差問題（借助專業(yè)的光學軟件Zemax、Code V等），如何選擇透鏡的面型 （結合透鏡的加工難度、價格等因素），如何盡可能用最少數(shù)量的透鏡達到光路的設計要求，如何在保證質(zhì)量要求的前提下盡可能減少系統(tǒng)的成本等等，這些都是我們在顯微儀器（包括冷凍電鏡這種高精尖儀器）光路系統(tǒng)設計過程當中所要面臨的問題，都與我們平時所學習的儀器專業(yè)基礎知識緊密結合。冷凍電子顯微學從 20世紀中葉開始，經(jīng)歷了 80年代到90年代的技術方法建立時期， 21世紀初的技術成熟期，在過去的兩年里發(fā)生了革命性的技術進步，進入了快速發(fā)展期。結構生物學和細胞生物學研究者如何抓住這個契機，如何盡快適應新

12、的局面，掌握新的技術，充分發(fā)揮該技術的優(yōu)勢從而更加深入地研究生命現(xiàn)象，將是未來幾年里的一個主題。 冷凍電鏡技術是一個多學科交叉的技術，數(shù)學、物理學、計算機、材料、化學等自然科學將在未來 冷凍電鏡技術的發(fā)展中扮演重要的角色，未來冷凍電鏡是否能夠取代X射線晶體學，成為今后結構生物學研究的主要工具，這一切都還是一個未知數(shù)。我國的結構生物學和儀器制造工作者應該抓住冷凍電鏡所帶來的全新機遇，不斷縮小自身與世界先進水平的差距，努力贏得新技術變革所帶來的挑戰(zhàn)。親愛的用戶：1、只要朝著一個方向努力，一切都會變得得心應手。20.6,286.28,202015:2415:24:26Jun-2015:24春妻春密畫刎新桃換恒符帝那桃花盛并28地方，在3、有勇氣承擔命運這才是英雄好漢。15:246.28.202015:246.28.202015:2415:24:266.28.202015:246.28.2020這醉火軻W坤節(jié)愿你嚏酒像春次554樣艷光，心情像桃5、閱讀使人充實，會談使人敏捷，寫作使人精確。Sunday, June 28, 2020June 2