毒理學(xué)研究方法

1、(課件重點(diǎn))毒理學(xué)研究方法1. 體內(nèi)試驗(yàn)(in vivo) ：也稱(chēng)整體動(dòng)物試驗(yàn)，可嚴(yán)格控制接觸條件，測(cè)定多種類(lèi)型的毒作用。大鼠，小鼠，豚鼠，家兔，狗和猴等。也有魚(yú)類(lèi)，鳥(niǎo)類(lèi)，昆蟲(chóng)等2體外試驗(yàn)(in vitro): 利用游離器官、培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞器、生物模擬系統(tǒng)進(jìn)行毒理學(xué)研究。器官(肝、胚胎)，細(xì)胞，細(xì)胞器，分子等3人體觀察(human toxicology)，事故或志愿者4流行病學(xué)研究(epidemiological study) ：為什么有選擇毒性1 物種和細(xì)胞學(xué)的差異( 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑) 2 蓄積能力3. 代謝過(guò)程和速率4. 損傷的修復(fù)能力非損害作用(non-adverse effect)所

2、致機(jī)體發(fā)生的一切生物學(xué)變化都是暫時(shí)的、可逆的，應(yīng)在機(jī)體代償能力范圍之內(nèi)，不造成機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及壽命的改變、不降低機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的能力和對(duì)額外應(yīng)激代償?shù)哪芰?、不影響機(jī)體的功能容量，如進(jìn)食量、體力勞動(dòng)負(fù)荷能力等涉及到解剖、生理生化和行為方面的指標(biāo)，也不引起機(jī)體對(duì)其他環(huán)境有害因素的易感性增高。損害作用(adverse effect)所致的機(jī)體生物學(xué)改變是持久的、不可逆的，造成機(jī)體功能容量的各項(xiàng)指標(biāo)改變、維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)能力下降、對(duì)額外應(yīng)激狀態(tài)的代償能力降低以及對(duì)其他環(huán)境有害因素的易感性增高，使機(jī)體正常形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程均受到影響，壽命縮短生物膜 biomembrane定義：將細(xì)胞或細(xì)胞器與周?chē)h(huán)

3、境分隔開(kāi)的一層半透膜。功能： 將細(xì)胞或細(xì)胞器與周?chē)h(huán)境隔離；保持細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)部理化性質(zhì)的穩(wěn)定；選擇地允許或部允許某些物質(zhì)通過(guò)，主動(dòng)攝入或排出一些物質(zhì)生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的機(jī)理1、被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)1)簡(jiǎn)單擴(kuò)散：溶液中的化學(xué)物質(zhì)分子，由濃集部位向各個(gè)方向分散，直到全部分子均勻分布在溶液中。simple diffusion:化學(xué)物質(zhì)由濃度較高部位透過(guò)生物膜向濃度較低部位分散的過(guò)程。特點(diǎn)：化學(xué)物不與膜起反應(yīng)；不消耗代謝能量；膜兩側(cè)濃度差愈大，脂溶性愈高，其簡(jiǎn)單擴(kuò)散速度快；在毒理學(xué)上，是大多數(shù)化學(xué)物透過(guò)生物膜的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式。簡(jiǎn)單擴(kuò)散的條件：膜兩側(cè)存在濃度差；外來(lái)化合物有脂溶性；是非解離狀態(tài)2)濾過(guò)filtration

4、:膜孔濾過(guò)指化學(xué)物通過(guò)細(xì)胞膜上的親水性孔道透過(guò)細(xì)胞膜的過(guò)程。親水性孔道：由嵌入脂質(zhì)雙分子層中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)親水性氨基酸組成，不同的細(xì)胞膜，其孔徑大小不一，小腸上皮細(xì)胞4Ao ， 腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為40 Ao。動(dòng)力： 滲透壓梯度和液體靜壓。在它們的作用下，大量水及分子直徑小于孔道的化學(xué)物可經(jīng)膜孔道，透過(guò)生物膜，完成其生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。2、特殊轉(zhuǎn)運(yùn)1)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)：不溶于脂質(zhì)的親水性化合物由低濃度處透過(guò)生物膜向高濃度處移動(dòng)并引起消耗能量的過(guò)程。特點(diǎn)：逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)；通過(guò)載體；需消耗能量；具有一定的選擇性，存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，可飽和；2)易化擴(kuò)散(facilitated diffusion): 指某些不易溶

5、于脂質(zhì)的親水性化合物，透過(guò)生物膜由高濃度處向低濃度處轉(zhuǎn)移的過(guò)程。其機(jī)理：化合物與膜上的蛋白質(zhì)或酶構(gòu)成的載體結(jié)合(與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相同)，只能由高向低轉(zhuǎn)移，它不需消耗代謝能量。3)膜動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)：指細(xì)胞與外界環(huán)境之間進(jìn)行的某些顆粒物或大分子物質(zhì)交換過(guò)程。此過(guò)程需要耗能。吞噬( phagocytosis) 胞飲 (pinocytosis) 胞吐( exocytosis )氣溶膠(aerosol) 指固體或/ 和液體微粒穩(wěn)定地懸浮于氣體介質(zhì)中形成的分散體系，其中的氣體介質(zhì)稱(chēng)為連續(xù)相，微粒稱(chēng)為分散相，其成分復(fù)雜，大小不一。分布的原因1）體內(nèi)各種屏障：血腦屏障，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毛細(xì)血管壁構(gòu)成，為緊密融合在一起的扁平

6、內(nèi)皮細(xì)胞，管外包裹的星形膠質(zhì)細(xì)胞。 胎盤(pán)屏障2）與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合a血漿中各種蛋白質(zhì)均有結(jié)合其他化學(xué)物的功能，特別是白蛋白的結(jié)合量最高。b不同的化合物與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合的量不同，結(jié)合型的化合物由于分子量大，不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，暫無(wú)生物效應(yīng)，不能被代謝排泄，可延緩消除過(guò)程和延長(zhǎng)化合物的毒作用。作用：兩重意義，即急性中毒的保護(hù)作用，使血液濃度降低；離開(kāi)接觸后，由于血液濃度下 降，貯存庫(kù)中的毒物重新就會(huì)釋放進(jìn)入血液，具有潛在的危害。主要與清蛋白濃度、結(jié)合親和力、與內(nèi)源性物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的差異3）與組織成分的結(jié)合指組織中的一些特殊結(jié)合蛋白，包括各種蛋白質(zhì)、粘多糖、核蛋白及磷脂。特殊的親和力，CO與血紅蛋白；百草枯

7、與肺肝、腎組織：金屬硫蛋白4）脂肪和骨骼中的貯存脂溶性的有機(jī)物易于分布和蓄積在脂肪組織內(nèi)；鉛、氟易于貯存在骨骼中；雙重性，降低血中毒物的濃度；重新釋放，將造成潛在的危害共氧化：指氫過(guò)氧化物的還原和其他底物氧化生成脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的過(guò)程葡糖醛酸結(jié)合是II相反應(yīng)中最普遍進(jìn)行的一種，由UDP葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶催化。谷胱甘肽結(jié)合，是由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶催化的 GSH吉合反應(yīng)。它在親電子化合物解毒及自由基解 毒中起著重要作用 生物轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性 1）多樣性：a一種外來(lái)化合物在體內(nèi)可能有多種不同的代謝轉(zhuǎn)化途徑，生成各種不同的代謝產(chǎn)物。b同一化合物經(jīng)不同的代謝，產(chǎn)生的毒性作用可能不同c化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化類(lèi)型

8、取決于化合物的性質(zhì)、劑量、環(huán)境及機(jī)體的因素，即影響毒 性作用的因素。2）連續(xù)性：外來(lái)化合物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化常常是多個(gè)反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行的。3）兩重性：生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果有解毒和增毒兩種。當(dāng)然，大多數(shù)是解毒。4）代謝飽和：外來(lái)化合物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，由酶催化進(jìn)行的，當(dāng)其濃度到一定程度，也就 是說(shuō)代謝過(guò)程所需的基質(zhì)可能被耗盡；代謝酶能力有限；造成單位時(shí)間內(nèi)代謝產(chǎn)物不再 隨底物增加而增加，有可能發(fā)生代謝途徑的改變，這種代謝途徑被飽和的現(xiàn)象稱(chēng)代謝飽 和（metablic saturation）。5）代謝酶的誘導(dǎo)與抑制：酶的誘導(dǎo)（induction）指有些外來(lái)化合物可使某些代謝酶合成增加 并伴有活力增強(qiáng)的現(xiàn)象。抑制

9、（inhibition）則是表現(xiàn)為活力下降影響毒性的因素 可分為四大類(lèi)：毒物、機(jī)體、接觸條件及外界環(huán)境。毒性效應(yīng)宿主因素環(huán)境因素基礎(chǔ)毒性分類(lèi)：根據(jù)接觸毒物的時(shí)間長(zhǎng)短分為急性毒性、短期重復(fù)劑量毒性、亞慢性毒性、慢性毒性。相應(yīng)所進(jìn)行的觀察和評(píng)價(jià)毒效應(yīng)的試驗(yàn)即為急性毒性試驗(yàn)、短期重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)。 急性毒性作用的有關(guān)參數(shù)Q以死亡為終點(diǎn)（上限參數(shù)）絕對(duì)致死劑量或濃度（LDI00或LC00）半數(shù)致死劑量或濃度（LD50或LC50）最小致死劑量或濃度（ MLD, LD01或MLC,LGi ）最大非致死劑量或濃度（MNLD, LD0或MNLC,LC）。非致死性指標(biāo)為檢測(cè)終點(diǎn)（下

10、限參數(shù)）急性毒性LOAEL既察到有害作用的最低劑量）急性毒性NOAEL去觀察到有害作用的劑量）為什么進(jìn)行替代試驗(yàn)？ ？ ？動(dòng)物保護(hù)；降低試驗(yàn)成本；縮短試驗(yàn)周期3R :替代，減少，優(yōu)化蓄積作用的意義1 .是外源化學(xué)物產(chǎn)生亞慢性、慢性毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。2 .是評(píng)價(jià)外源化學(xué)物是否可能產(chǎn)生慢性中毒的重要指標(biāo)。3 .在制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，蓄積毒性的大小是選擇安全系數(shù)的重要考慮因素之一。4 .耐受也是蓄積毒性的表現(xiàn)之一。亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)劑量與設(shè)組原則：設(shè)3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照組。設(shè)及劑量時(shí)應(yīng)考慮人類(lèi)的實(shí)際接觸量。高劑量：動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的中毒效應(yīng)，不發(fā)生或僅有個(gè)別死（10% ）。中間劑量：動(dòng)物出現(xiàn)

11、輕度中毒效應(yīng)，應(yīng)相當(dāng)于最小有作用劑量水平（ LOAEL）. 低劑量：無(wú)中毒反應(yīng)，應(yīng)相當(dāng)于最大無(wú)作用劑量水平 （NOAEL）。要高于人得實(shí)際接觸水平。 對(duì)照組：排除混雜因素劑量組間的組距 24倍，最大不超過(guò)10倍。 劑量設(shè)計(jì)參考原則和方法對(duì)能求出LD0的化學(xué)物：參考同一動(dòng)物種屬品系和同一染毒途徑的短期毒性資料，最高劑量組為1/10- 1/20LD so,最低劑量至少為人體攝入量的3倍。再設(shè)中間劑量。對(duì)食品藥品等毒性很低的化學(xué)物：藥品以臨床用藥量的10,30,100倍（大鼠）食品以人體攝入量的 100, 200,300倍（大鼠）慢性毒T試驗(yàn)：參考亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)。急性毒性作用概念及急性毒性實(shí)

12、驗(yàn)?zāi)康?；亞慢性毒性作用概念及亞慢性毒性?shí)驗(yàn)?zāi)康?；慢性毒性作用概念及慢性毒性?shí)驗(yàn)?zāi)康?；蓄積毒性與蓄積系數(shù) ；LD50; NOAEL;LOAE;LADI;臟器系數(shù)；食物利用率 化學(xué)致癌物 致癌機(jī)制：遺傳毒性致癌物 +非遺傳毒性致癌物（表觀遺傳毒性致癌物） 代謝角度：直接致癌物 +間接致癌物（前致癌物，近致癌物，終致癌物） 致癌階段：引發(fā)劑+促長(zhǎng)劑+助致癌物+完全致癌物化學(xué)致癌的三階段學(xué)說(shuō)；化學(xué)致癌的機(jī)制；化學(xué)致癌物的分類(lèi)；判斷化學(xué)致癌物的試驗(yàn)方法2、選擇致突變?cè)囼?yàn)的成套觀察項(xiàng)目（ test battery ）配套原則：1.多種遺傳學(xué)終點(diǎn)兼顧。2.多種物種兼顧。3.體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)配合。4.體細(xì)胞與生

13、殖細(xì)胞兼顧 。 致突變?cè)囼?yàn)與致癌試驗(yàn)的關(guān)系 致突變?cè)囼?yàn)是致癌短期篩檢試驗(yàn)中的一種，可檢出遺傳毒性致癌物。 但也能出現(xiàn)假陽(yáng)性如遺傳毒性非致癌物和假陰性如非遺傳毒性致癌物。1. 發(fā)育毒性（developmental toxicity ）:指出生前后接觸有害因素，子代個(gè)體發(fā)育為成體之前誘發(fā)的任何有害影響。具體表現(xiàn)為(1)發(fā)育生物體死亡：吸收胎、流產(chǎn)、死胎、(2)生長(zhǎng)改變：生長(zhǎng)遲緩：生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)低于正常對(duì)照均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(3)結(jié)構(gòu)異常：畸形，包括外觀畸形，骨骼畸形，內(nèi)臟畸形。(4)功能缺陷：出生后個(gè)體免疫，神經(jīng)行為缺陷，兒童早期腫瘤2 .發(fā)育毒理學(xué)(developmental toxicology)

14、 :研究出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機(jī)制、發(fā)病機(jī)理、影響因素和毒物動(dòng)力學(xué)等。是毒理學(xué)的重要分支之一。3 .畸形(malformation ):發(fā)育生物體解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。分為嚴(yán)重畸形和輕微畸形。嚴(yán)重畸形(major malformation )：對(duì)外觀、生理功能和(或)壽命有明顯影響輕微畸形(minor malformation ):對(duì)外觀、生理功能只有輕微影響或沒(méi)有影響。4 .器官形成期(critical peroid) :從胚泡著床到硬腭閉合的時(shí)期，是畸形發(fā)生的關(guān)鍵時(shí) 期，也成致畸敏感期。5 .致畸物(致畸原teratogen):能引起畸形的環(huán)境因子。6 .

15、致畸作用(teratogenesis )致畸物引起畸形的過(guò)程 。7 .致畸性(teratogenicity ):致畸物引起畸形的能力。8 .變異(variation ):同一種屬的親代和子代之間或子代的個(gè)體之間，出現(xiàn)不同程度的差異。變異由遺傳和遺傳外因素控制,或由于分化改變而引起。一般變異指小的或次要的結(jié)構(gòu)改變，一般不影響正常生理功能，也不危及生命。值得注意的變異是致畸試驗(yàn)中，有劑量效應(yīng)關(guān)系異常增多的變異。9 、 胚體毒性(embryotoxicity ):外源性理化因子對(duì)孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束時(shí) 的有害影響。10、胎體毒性或胎兒毒性(fetoxicity ): 對(duì)孕體器官形成期結(jié)束以后的有害影響。11、胚胎毒性(embryo-fetal toxicity) :胚體毒性和胎體毒性的統(tǒng)稱(chēng)。一般指孕體的死亡 和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，不包括結(jié)構(gòu)畸形。胚胎毒性12、出生缺陷(birth defect ):指出生前期即已形成的發(fā)育障礙，主要包括畸形和功能 缺陷。13