實驗十水中大腸菌群含量測定

1、實驗十實驗十 水中大腸水中大腸菌群的測定（綜合性菌群的測定（綜合性實驗）實驗）一、目的要求一、目的要求 1 1學習測定水中大腸菌群數(shù)量的多管學習測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法。發(fā)酵法。 2 2了解大腸菌群的檢測作為飲水衛(wèi)生了解大腸菌群的檢測作為飲水衛(wèi)生指標的重要性。指標的重要性。二、基本原理二、基本原理 多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗、平板分離多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分。和復發(fā)酵試驗三個部分。 1 1初（步）發(fā)酵試驗初（步）發(fā)酵試驗 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用

2、，因。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細菌的產(chǎn)酸情況，乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pHpH指示劑，指示劑，細菌產(chǎn)細菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲。溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。 水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，3737下培養(yǎng)，下培養(yǎng)，2424小時小時內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改

3、變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果，色改變，說明水中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰性結(jié)果。在量少的情況下，也可能延遲到性結(jié)果。在量少的情況下，也可能延遲到4848小小時后才產(chǎn)氣，此時應視為可疑結(jié)果，因此，以時后才產(chǎn)氣，此時應視為可疑結(jié)果，因此，以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。確定是否是大腸菌群。4848小時后仍不產(chǎn)氣的為小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。陰性結(jié)果。 2 2平板

4、分離平板分離 平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養(yǎng)基，脂（遠藤氏培養(yǎng)基，EndoEndos mediums medium）或）或伊伊紅美藍瓊脂紅美藍瓊脂（eosin methylene blueagareosin methylene blueagar，EMB agarEMB agar），前者含有堿性復紅染料，在此），前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復紅反應，形成深糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復

5、紅反應，形成深紅色復合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟饧t色復合物，使大腸菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的澤的深紅色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長。生長。 伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結(jié)合成復合物，使大腸環(huán)境時，該兩種染料即結(jié)合成復合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的、菌群產(chǎn)生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發(fā)酵管初發(fā)酵管242

6、4小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和4848小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。的均需在以上平板上劃線分離菌落。 3 3復發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗 以上大腸菌群陽性菌落，以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再進一革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)經(jīng)2424小時培小時培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。果。三、器材三、器材 1 1、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)

7、有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水；管（瓶）（內(nèi)有倒置小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水； 2 2、儀器或其他用具、儀器或其他用具 載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟四、操作步驟 1 1水樣的采取水樣的采取 1)1)自來水自來水 先將自來水龍頭用火焰燒灼先將自來水龍頭用火焰燒灼3min3min滅菌，再開放水滅菌，再開放水龍頭使水流龍頭使水流5min5min后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。后，以滅菌三角燒瓶接取水樣，以待分析。 2 2）池水、河水或湖水）池水、河

8、水或湖水 應取距水面應取距水面101015cm15cm的深層水樣，的深層水樣，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。最好立即檢查，否則需放入冰箱充分冷卻。取出。最好立即檢查，否則需放入冰箱充分冷卻。 2 2自來水檢查自來水檢查（1 1）初（步）發(fā)酵試驗在）初（步）發(fā)酵試驗在2 2個含有個含有50ml50ml三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入三倍濃縮的乳糖蛋白胨發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml100ml水樣。在水樣

9、。在1010支含有支含有5ml5ml三倍濃縮乳糖蛋三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入白胨發(fā)酵管中，各加入10ml10ml水樣（如圖水樣（如圖-1-1）?；靹蚝?，）?；靹蚝螅?737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時，小時，2424小小時未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至時未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至4848小時。小時。（2 2）平板分離經(jīng)）平板分離經(jīng)2424小時培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸小時培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及產(chǎn)氣及4848小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于3737下培養(yǎng)下培養(yǎng) 18182424小時，將符合下列特征小時，將符合下列特征的菌落的一小部

10、分，進行涂片，革蘭氏染色，的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢。 （a a）深紫黑色、有金屬光澤。）深紫黑色、有金屬光澤。（b b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c c）淡紫紅色、中心顏色較深。）淡紫紅色、中心顏色較深。 （3 3）復發(fā)酵試驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革）復發(fā)酵試驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部蘭氏陰性無芽孢桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落落1 1

11、3 3個，個， 3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時，結(jié)果若產(chǎn)酸又小時，結(jié)果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。 證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管（瓶）數(shù)查表驗的陽性管（瓶）數(shù)查表-2-2，即得大腸菌，即得大腸菌群數(shù)。群數(shù)。 3 3池水、河水或湖水等的檢查池水、河水或湖水等的檢查（1 1）將水樣稀釋成）將水樣稀釋成1010-1-1與與1010-2-2。（2 2）分別吸取）分別吸取1ml101ml10-2-2、1010-1-1的稀的稀釋水樣和釋水樣和1ml1ml原水樣，各裝入有原水樣，各裝入有10ml10ml普普通濃度乳糖蛋白

12、胨發(fā)酵管中。另取通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml10ml和和100ml100ml原水樣，分別注入裝有原水樣，分別注入裝有 5 5 mlml和和50ml50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管（瓶）中。的試管（瓶）中。 （3 3）以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。）以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。（4 4）將）將100100、1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）mlml水樣的發(fā)酵管水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表結(jié)果查表-3-3，將，將1010、1 1、0.10.1（1010-1-1）、）、0.010.01（1010-2-2）mlml水樣的發(fā)酵

13、管結(jié)果查表水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表-4-4，即得每升水樣中的大，即得每升水樣中的大腸菌群數(shù)。腸菌群數(shù)。初發(fā)酵前初發(fā)酵后陽性管-產(chǎn)酸、產(chǎn)氣結(jié)果EMB平板分離典型結(jié)果1-綠色金屬光澤菌落EMB平板分離典型結(jié)果2-黑紫色不帶或略帶金屬光澤菌落EMB平板分離典型結(jié)果3-淡紫紅色中心顏色較深菌落復發(fā)酵實驗結(jié)果-產(chǎn)酸、產(chǎn)氣五、實驗報告五、實驗報告 （1 1）自來水）自來水100ml100ml水樣的陽性管數(shù)是多少？水樣的陽性管數(shù)是多少？10ml10ml水樣的陽性管數(shù)是多少？水樣的陽性管數(shù)是多少？查表查表-2-2得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？（2 2）池水、河水或湖水）池水、河水或湖水 陽性結(jié)果記陽性結(jié)果記“+ +”；陰性結(jié)果記；陰性結(jié)果記“- -”。 查表查表-3-3得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？ 查表查表-4-4得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？得每升水樣中大腸