實驗三雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定

1、蛋白質(zhì)含量測定 雙縮脲法（Biuret法） 實驗目的1學習分光光度法測定的原理和方法2學習蛋白質(zhì)含量測定的原理和方法3掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法實驗原理 雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。 紫色絡合物 紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：Tris緩沖液和某

2、些氨基酸等。 此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。 蛋白質(zhì)測定方法:1雙縮脲法（biuret法） 2微量凱氏（kjeldahl）定氮法 3folin酚試劑法4考馬斯亮蘭法5紫外吸收法 6總蛋白定量分析BCA實驗試劑與器材 （一）、實驗試劑 1、標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005N NaOH配制。 2、雙縮脲試劑 （二）、實驗器材 可見光分光光度計 分光光度計

3、的基本原理是溶液中的物質(zhì)在光的照射下，產(chǎn)生了對光吸收的效應，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合比色原理Lambert-Beers law: 數(shù)學表達式: A=lg(1/T)=KCL A為吸光度 T為透射率,是投射光強度比上入射光強度 C為吸光物質(zhì)的濃度 L為吸收層厚度 K為吸收系數(shù) 物理意義是當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的西光物質(zhì)時,其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收層厚度L成正比. 儀器操作鍵介紹“方式設定”鍵（MODE）：用于設置測試方式“10

4、0%T/0ABS”鍵：用于自動調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動調(diào)整零透射比“波長設置”旋鈕：用于設置分析波長樣品測試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預熱20分鐘 用“波長設置”按鈕將波長設置在您將要使用的分析波長位置上 打開樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路 蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零 取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比 按“方式鍵”（MODE）將測試方式設置為吸光度方式(A) 將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中 打開樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋 將參比溶液推入或拉

5、入光路中，按“100%T”調(diào)零A 將被測溶液拉入光路中，此時，顯示器上所顯示是被測樣品的吸光度參數(shù)實驗完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。 使用注意:1每次測量前檢查,檢查波長是否所需值;2比色皿應拿磨砂面,不可用手接觸透光面;3比色皿在盛裝樣品前,應用所盛樣品沖洗兩次,裝樣量為比色皿的2/3容積;4向比色皿加樣時,若樣品流到比色皿外壁時,應用濾紙點干,切忌用濾紙擦拭,比色皿易出現(xiàn)劃痕;5測量結(jié)束后應用蒸餾水清洗比色皿,清洗干凈后放起.操作方法 1、標準曲線的測定 取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025）下放置20分鐘，于540nm處進行比色測定(30分鐘內(nèi)必須完成測定)。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。2、樣品的測定 取2-3個試管，用上述