流式細(xì)胞儀操作步驟FACSCalibur

1、一、開(kāi)機(jī)程序：1.檢查鞘液桶和廢液桶。確認(rèn)鞘液充滿(mǎn)狀態(tài)（鞘液為鞘液桶體積的3/4位置，可以連續(xù)工作3個(gè)小時(shí)左右）、蓋緊黑蓋、管道暢通、廢液桶有足 夠空間容納本批標(biāo)本排棄的廢液。如果要添加鞘液，要先釋放鞘液桶中 氣壓。2.依次打開(kāi)流式細(xì)胞儀FACSCalibur穩(wěn)壓器、主機(jī)開(kāi)關(guān)、電腦開(kāi)關(guān)，打印 機(jī)。3.氣壓閥置丁加壓位置，待流式細(xì)胞儀處丁STANDB狀態(tài)，做Prime,以 排除管路中氣泡。二、 運(yùn)行FACSComp件、檢查儀器狀況1.制備三色標(biāo)準(zhǔn)微球樣本。一般情況向1ml鞘液（或過(guò)濾PBS中加入1滴質(zhì)控小微球，也可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)濃度。2.機(jī)器預(yù)熱5 min，打開(kāi)FACSComp件，選擇保持路

2、徑。選擇所需校 正內(nèi)容，如果使用的微球是新一批產(chǎn)品要 輸入微球的批號(hào)。3.在軟件界面左側(cè)Assay Selection選項(xiàng)中選擇質(zhì)控類(lèi)型，即實(shí)驗(yàn)過(guò) 程中是否需要活洗樣品。4.上樣品，微球溶液上樣之前要充分混勻。 功能鍵設(shè)置在“RUN。5.儀器自動(dòng)檢查，并做電壓、補(bǔ)償?shù)仍O(shè)置。6.FACSComp件運(yùn)行完畢，顯示結(jié)果通過(guò)測(cè)試。7.做Set up。8.打印校正結(jié)果，退出FACSComP序。備注：在質(zhì)控過(guò)程中，如果提示收集細(xì)胞速度慢可以提高細(xì)胞收集速度，但是在調(diào)節(jié)靈敏度（Sens）時(shí)，一定要用“LoW的狀態(tài)上樣，保證儀器靈敏度的準(zhǔn)確。在使用儀器過(guò)程中要養(yǎng)成好的習(xí)慣，在上樣品過(guò)程中，儀器保持在“LowT

3、Standby”狀態(tài)。三、 樣品分析軟件：CellQuest Pro1.保證機(jī)器預(yù)熱5 min，打開(kāi)CellQuest Pro軟件，選擇“聯(lián)機(jī)”。AcquirerConnect to Cytometer（1）在彈出的界面中的選擇數(shù)據(jù)存儲(chǔ)路徑（Directory菜單）；（2）對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行命名；（3）對(duì)實(shí)驗(yàn)通道進(jìn)行預(yù)設(shè)（FSC,SSC,FL1-FL4 備注：如果界面被關(guān)閉，重新調(diào)出步驟:WindowsShow Browers2.調(diào)出質(zhì)控模板。個(gè)常用選項(xiàng)進(jìn)行設(shè)定：將散點(diǎn)圖選中（用鼠標(biāo)點(diǎn)擊散點(diǎn)圖邊框才能夠標(biāo)表示名稱(chēng)，設(shè)置十字象限。如果要做四色實(shí)驗(yàn)，則繪制四個(gè)圖。備注：第一個(gè)散點(diǎn)圖橫坐標(biāo)為FSC縱坐標(biāo)

4、為SSC個(gè)細(xì)胞。FS獸日SS股用線性（Lin ），激光通道（FL1-FL4）一般用對(duì)數(shù)（Log）。4.上陰性對(duì)照將陰性對(duì)照管混勻，上機(jī)，功能鍵設(shè)置在“RUN ,散點(diǎn)圖出現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)，第一個(gè)圖：讓細(xì)胞信號(hào)出現(xiàn)在自己看上去舒服的區(qū)域； 其他三個(gè) 散點(diǎn)圖，要將細(xì)胞信號(hào)調(diào)整到陰性區(qū)域，即左下角區(qū)域。通過(guò)移動(dòng)通Instrument SettingsBD FilesOpenOpenInstrument SettingsSet（一定要做）Done3.畫(huà)圖選擇畫(huà)圖工具（一般選擇散點(diǎn)圖）,Inspect界面會(huì)自動(dòng)彈出，對(duì)幾選中圖形），將Analysis改為AcquireApalysis更改橫縱坐（1）設(shè)定獲取細(xì)胞

5、數(shù)目:AcquireAcquisition &一般獲取10000(2)調(diào)出電壓、閾值和補(bǔ)償?shù)冉缑妗墓ぞ邫贑ytometer選項(xiàng)中調(diào)出（1,2,3和4）(3)將所有補(bǔ)償調(diào)為00Complement(4)將非52的閾值調(diào)為0。Threahold(5)(6)調(diào)出細(xì)胞計(jì)數(shù)器:AcquireCounter選擇調(diào)用的質(zhì)控文件道電壓來(lái)實(shí)現(xiàn)。獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：暫停剛才實(shí)驗(yàn)PauseI Abort注意：在獲取細(xì)胞之前，要將Set up前面的勾子取消。上單陽(yáng)管，調(diào)節(jié)功能鍵“RUN，如果細(xì)胞信號(hào)出現(xiàn)在雙陽(yáng)區(qū)域，說(shuō)明有細(xì)胞信號(hào)露到相鄰?fù)ǖ乐校獙⒓?xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)到單一通道中。通過(guò)移動(dòng)通道補(bǔ)償來(lái)實(shí)現(xiàn)，想要細(xì)胞信號(hào)向哪

6、個(gè)通道移動(dòng)，就用散點(diǎn)圖中 的另一個(gè)通道去減，即想要移動(dòng)的那個(gè)通道作為減數(shù)。如在FL1和FL2兩個(gè)通道組成的散點(diǎn)圖中，細(xì)胞信號(hào)出現(xiàn)在雙陽(yáng)區(qū)域，要將細(xì)胞 信號(hào)移動(dòng)到FL1通道，就要調(diào)節(jié)FL2-FL1對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償， 直到細(xì)胞信號(hào) 只出現(xiàn)在FL1通道中， 這樣可以消除漏到FL2通道中的信號(hào)。備注：FL1-FITC, FL2-PE, FL3-PerCP, FL4-APC根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇流速，按設(shè)置順序上樣。6.點(diǎn)擊“Acquire”命令，儀器開(kāi)始獲取數(shù)據(jù)，并自動(dòng)將數(shù)據(jù)文件保存 到規(guī)定的目錄下。7.樣本獲取完畢，功能鍵設(shè)置在“STANDBY并選擇“脫機(jī)”命令。8.點(diǎn)擊“Quit”命令，退出CellQuest

7、軟件。9.關(guān)機(jī)：（1） 1%次氯酸，高速（Hi） “RUN 5-10 min, Acquire如果 細(xì)胞計(jì)算器中不顯示有細(xì)胞則表示管道已經(jīng)干凈。（2）用雙蒸水高速（Hi） “RUN 5-10 min , Standby 5 min,關(guān) 機(jī)。四、DNA音性分析實(shí)驗(yàn)：一、儀器情況檢測(cè)，DNA音性分析的質(zhì)控用CellQuest Pro軟件進(jìn)行。1.（1）保證機(jī)器預(yù)熱5 min,打開(kāi)CellQuest Pro軟件，選擇“聯(lián)機(jī)”Acquire*Connect to Cytometer做質(zhì)控時(shí)，需要畫(huà)三個(gè)圖，第一個(gè)是散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)是FSC，縱坐標(biāo)是SSC;第二個(gè)是散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)是FL2-Width，縱坐標(biāo)

8、是FL2-Area;第三個(gè)是直方圖，橫坐標(biāo)是FL2-Area ,縱坐標(biāo)是Counter。做DNA倍性實(shí)驗(yàn)時(shí)一般使用PI染色，所以選擇用第二通道 （FL2）。DNA倍性分析不需要調(diào)節(jié)補(bǔ)償。因?yàn)閷儆趩紊珜?shí)驗(yàn)，所以把電壓界面Four color前的勾去掉。將信號(hào)接收方式“Log”改為“Lin ”，DDM Pram改為“FL2”。閾值使用Acquire5.FL2,而不是FSC。去掉細(xì)胞群中粘連體，上樣本，利用第二個(gè)圖，調(diào)節(jié)FL2-A和FL2-W電壓，使細(xì) 胞群信號(hào)顯示在橫縱坐標(biāo)200位置，通常血細(xì)胞中單細(xì)胞成45 C，粘連體體積會(huì)比單細(xì)胞 大，大概在橫坐標(biāo)400位置。保存質(zhì)控。二、DN臨性分析用Mod

9、Fit LT軟件進(jìn)行。(1)打開(kāi)ModFit LT軟件，調(diào)出樣品檢測(cè)結(jié)果，(2)選擇面積(FL2-A)，選定X軸：FL2-W Y軸：FL2-A。(3)可以點(diǎn)擊Auto選項(xiàng)，進(jìn)行結(jié)果自動(dòng)分析，也可以選擇Manuale ,人工分析。FACSCalibur每日開(kāi)機(jī)程序1.檢查鞘液桶，確認(rèn)：鞘液充滿(mǎn)狀態(tài)(3 升)管路暢通，無(wú)扭曲2.檢查廢液桶，確認(rèn)：廢液桶充滿(mǎn) 100ml 漂白劑管路暢通，無(wú)扭曲3. 打開(kāi)流式細(xì)胞儀。4. 打開(kāi)電腦。5. 氣壓閥置于加壓位置，并排除管路中氣泡。6. 做 Prime。7.等待機(jī)器預(yù)熱 5-10分鐘后可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)FACSCalibur每日關(guān)機(jī)程序1.用 2ml10嘛釋漂白劑（有效氯 0.5-1%）作樣品，將樣品支