東師實驗2不同大豆品種質(zhì)量分析

1、綜合研究性實驗二：不同大豆品種質(zhì)量分析一.實驗?zāi)康臎Q定大豆質(zhì)量的主要指標(biāo)是蛋白質(zhì)和油脂含量。東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院苗以農(nóng)教授從事大豆育種的科學(xué)研究工作四十余年。本實驗以苗以農(nóng)教授提供的幾種大豆育種材料為研究對象并完成以下學(xué)習(xí)目標(biāo)：1.學(xué)習(xí)凱氏定氮測定蛋白質(zhì)含量的原理和操作技術(shù)；2.學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)溶液配置與標(biāo)定的原理與操作；3.規(guī)范分析化學(xué)的基本操作技能（電子天平、容量瓶、移液管等儀器的使用方法）；4.學(xué)習(xí)利用索氏提取器及減重法測定大豆粗脂肪的含量；5.掌握誤差與分析數(shù)據(jù)處理的相關(guān)知識；6.學(xué)習(xí)有機溶劑的回收的方法（簡易蒸餾裝置、旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀、真空泵的使用）；7.6molHCl將蛋白質(zhì)水解為氨基酸

2、以及氨基酸衍生物的前處理方法；8.了解利用高壓液相色譜法HPLC測定大豆氨基酸組成的原理和方法。二.大豆粗脂肪的提取和定量分析一實驗原理1.用有機溶劑和索氏提取器可以循環(huán)抽提樣品中的脂溶性物質(zhì)的混合物。2.由于大豆中含有脂肪、游離脂肪酸、固醇、芳香油、某些色素及有機酸等，因此稱為粗脂肪。3.本實驗就是利用有機溶劑石油醚和索氏提取器循環(huán)抽提大豆中的粗脂肪。二實驗器材和試劑1.實驗試劑與原料（1）大豆粉（2）石油醚2.用品與儀器（1）索氏提取器（2）電子天平（3）燒杯（4）烘箱（5）干燥器（6）恒溫水?。?）脫脂濾紙（8）脫脂棉（9）鑷子三樣品處理樣品處理步驟1.粉  

3、0;    碎在研缽中研碎大豆樣品，研磨后缽體用脫脂棉擦掙，并放入提取漏斗，研缽用少量乙醚洗凈，裝入提取管。2. 烘干與稱重將大豆樣品在110烘箱內(nèi)烘干至恒重，冷卻后稱取5-6g樣品，記下樣品質(zhì)量m0。將大豆樣品放入脫脂濾紙做成的提取漏斗中，放在盛有CaCl2真空干燥器中干燥。稱量大豆樣品和濾紙的質(zhì)量和m1。四提取（一）索氏提取器的安裝將洗凈的提取瓶在105的烘箱內(nèi)烘干至恒重，加入用CaCl2干燥的石油醚至抽提瓶容積的1/2，將大豆樣品包置于抽提管內(nèi)，然后依照下圖連接實驗裝置。（二）提取過程提取過程加熱恒溫水浴，使石油醚蒸發(fā)。石油醚蒸汽由連接管上升至冷凝器，凝結(jié)成

4、液體，滴入提取管中，樣品內(nèi)的脂肪被石油醚所抽提。石油醚液面高于虹吸管高度后，溶有脂肪的石油醚經(jīng)虹吸管流入提取瓶。循環(huán)抽提，調(diào)節(jié)水浴溫度，控制石油醚從冷凝器滴入濾紙筒內(nèi)的速度為150dpm，使石油醚循環(huán)10-20tpm。從提取管內(nèi)吸取少量石油醚滴在干凈的濾紙上，石油醚蒸干后，濾紙上不留有油脂的斑點，說明抽提已經(jīng)完畢。抽提完畢后，冷卻，使提取器傾斜，石油醚流回提取瓶中。取出濾紙包，干燥至恒重，稱其質(zhì)量m2。（三）利用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀回收石油醚四數(shù)據(jù)計算稱量名稱數(shù)值所稱大豆樣品質(zhì)量m0 抽提前大豆樣品和濾紙的質(zhì)量m1 抽提后大豆樣品和濾紙的質(zhì)量m2 計算結(jié)果（粗脂肪%）&

5、#160;參考數(shù)值 五注意事項1.將濾紙筒放入索氏提取器的提取管內(nèi)時，不能高于虹吸部分。2.提取管磨口連接部分不能涂凡士林，但不能漏氣。3.加熱抽提時，應(yīng)在電熱恒溫水浴中進行，不能使用火焰加熱的水浴鍋。三.凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量一實驗原理實驗室常用凱氏定氮法測定天然有機物（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸）的含氮量。1.標(biāo)定（1）NaOH固體中含有Na2CO3雜質(zhì)，而且容易吸濕；鹽酸易揮發(fā)，準(zhǔn)確濃度不確定，因此NaOH與鹽酸均不能直接配成準(zhǔn)確濃度的溶液，而必須先配成一個近似濃度的溶液，再用標(biāo)準(zhǔn)溶液來標(biāo)定。（2）由于KHC8H4O4（鄰苯二甲酸氫鉀，物質(zhì)的量為204.22）穩(wěn)定，又可以與Na

6、OH反應(yīng)，可用于標(biāo)定NaOH的摩爾濃度，進而標(biāo)定鹽酸的摩爾濃度。2.消化含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳和氫兩種元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉(zhuǎn)化成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨，此過程稱為消化。由于反應(yīng)比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點，并加入硫酸銅或過氧化氫作為催化劑。例如：甘氨酸的消化過程如下：CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH32NH3+H2SO4(NH4)2SO43.蒸餾濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量、濃度硼酸溶液中，硼酸吸收氨后溶液中的氫離子濃度降低。(NH4)2SO4+2NaOH

7、=Na2SO4+2H2O+2NH3H3BO3（粉紅色）+3NH3=(NH4)3BO3（鮮綠色）4.滴定及計算（1）用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度。（2）根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的摩爾數(shù)計算出待測液的總氮量。3HCl+(NH4)3BO3=3NH4Cl+H3BO3（顏色變回粉紅色）二實驗器材和試劑1.實驗試劑與原料（1）混合指示劑儲備液取50mL，0.1%甲烯藍乙醇溶液與200mL，0.1%甲基紅乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶中，備用。本指示劑在pH=5.2時為紫紅色；在pH=5.4時為暗藍色（或灰色）；在pH=5.6時為綠色，變色點pI=5.4，所以指示劑的變色范圍很窄，靈敏。（2）硼酸指示劑混

8、合液取100mL，2%硼酸溶液，滴加混合指示劑儲備液（大約1mL），搖勻后，溶液呈紫紅色即可。（3）濃硫酸（4）40NaOH溶液（5）0.0100mol/L左右標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液（6）粉末K2SO4、CuSO4混合物（K2SO4：CuSO4·5H2O=5:1）（7）標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液（0.3mg氮/mL）2.儀器與用品（1）100mL凱氏燒瓶（2）改進凱氏定氮儀（3）50mL容量瓶（4）5mL微量滴定管（5）電子天平（6）烘箱（7）電爐（8）遠紅外消煮爐（9）移液管（10）酒精燈三樣品處理大豆樣品中的含氮量是用100g大豆中含氮的g數(shù)來表示（%）。因此在定氮前，應(yīng)將大豆樣品中的水分除掉。一般

9、樣品烘干溫度為105。樣品處理步驟稱取一定質(zhì)量的大豆粉（約0.1000g左右），記下大豆粉的質(zhì)量m0在稱量瓶中裝一定量磨細(xì)大豆粉樣品，置于105烘箱中烘干4h用坩堝鉗將稱量瓶放入干燥器內(nèi)，降至室溫后稱重按上述操作繼續(xù)烘干樣品每干燥1h后，稱重，直到2次稱重數(shù)值不變四消化消化步驟取2個100mL凱氏燒瓶，標(biāo)號1號加樣品（約0.1000g），催化劑（K2SO4-CuSO4·5H2O）約200mg，濃硫酸5mL2號加0.1mL蒸餾水，催化劑（K2SO4-CuSO4·5H2O）約200mg，濃硫酸5mL*每個瓶口放一個漏斗，在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上消化*消化完畢，燒瓶中溶物冷卻后，加蒸餾

10、水10mL冷卻后將瓶中溶物傾入50mL容量瓶中，用水稀釋到刻線*作為對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)。*將消化管放入60水浴中緩慢分解約24h，至消化液呈褐色，滴加2滴過氧化氫，繼續(xù)在通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上消化2h，直至透明淡綠色為止。五蒸餾（一）改良式凱氏蒸餾儀的洗滌1.反應(yīng)室；2.蒸汽發(fā)生室；3.加樣口（小漏斗）并夾子；4.冷凝器；5.冷凝水入口；6.冷凝水出口；7.夾子；8.夾子（廢液排除口）；9.錐形瓶；10.出樣口；11.煤氣燈1.取5個5OmL的錐形瓶，各加5mL2%硼酸指示劑混合液，應(yīng)呈紫紅色，用表面皿覆蓋備用。2.打開夾子7，使冷水流入蒸氣發(fā)生器內(nèi)球體2/3量后關(guān)閉夾子7。

11、將煤氣燈放到蒸氣發(fā)生器2下面加熱，此時夾子3和8處于關(guān)閉狀態(tài)蒸氣通過反應(yīng)室1到冷凝器4外腔，凝成水滴灑落于盛混合液的三角瓶9中。如此用蒸氣洗滌反應(yīng)室約10min后，移去三角瓶，放上另一個盛混合液的三角瓶，將瓶傾斜，以保證冷凝管末端連接的小玻璃管完全浸于液體內(nèi)。繼續(xù)蒸餾2min 。觀察三角瓶內(nèi)溶液是否變色，如不變成鮮綠色，而是變成灰色或暗色，則表明反應(yīng)室內(nèi)部己干凈。移動三角瓶使混合液離開管口約1cm，繼續(xù)通氣1min ，最后用水沖洗管外口，移開煤氣燈，準(zhǔn)備下一步把消化液加入反應(yīng)室內(nèi)。（二）消化樣品及空白的蒸餾打開夾子8，放掉蒸氣發(fā)生器中的熱水，然后關(guān)閉夾子8，打開夾子7，使冷水流人蒸氣發(fā)生器內(nèi)球

12、體2/3量后關(guān)閉夾子7。這一步操作對加樣時避免樣品經(jīng)出樣口10抽出反應(yīng)室是很關(guān)鍵的。打開夾子3，取2mL稀釋消化液自加樣口3加大反應(yīng)室1，關(guān)閉夾子3。另取l個盛混合液的三角瓶斜接于冷凝管下端。取40%NaOH溶液約10mL，放人加樣口的小漏斗中，微開夾子3，使NaOH溶液饅慢流人反應(yīng)室，當(dāng)未完全流盡時，關(guān)閉夾子3，向小漏斗加入約5mL蒸餾水，再微開夾子3，使一半蒸餾水流人反應(yīng)室，關(guān)閉夾子3，一半蒸餾水留在小漏斗中作水封。將煤氣燈放回蒸氣發(fā)生器下面，繼續(xù)加熱蒸餾，三角瓶中溶液由紫紅色變成鮮綠色，自變色起開始記時，蒸餾5min，然后移動三角瓶使液面離開冷凝管口約1cm，并用少量蒸餾水洗滌冷凝管口外

13、周，繼續(xù)蒸餾1min。用表面皿覆蓋三角瓶，待其余樣品蒸餾完畢后，一同滴定。（三）蒸餾后蒸餾儀的洗滌樣品蒸餾完畢后，挪開錐形瓶及煤氣燈，隨即自加樣口較快地倒人一些冷蒸餾水，反應(yīng)室外的空氣驟然冷縮，反應(yīng)室內(nèi)的廢液迅速地從出樣口10抽出，打開夾子8，排出蒸氣發(fā)生器內(nèi)的廢液，關(guān)閉夾子8。再自加樣口加入一些冷蒸餾水，打開夾子3，冷水再流人反應(yīng)室，關(guān)閉夾子3，打開夾子7，使冷水盡量多地流人蒸氣發(fā)生器內(nèi)，但不要超過出樣口10，關(guān)閉夾子7，打開夾子8，使冷水排出。此時，由于蒸氣發(fā)生器內(nèi)的空氣壓力降低較多，反應(yīng)室中冷水又自動抽出。如此反復(fù)幾次，即可排盡反應(yīng)廢液及洗滌廢液。六滴定全部蒸餾完畢后，用已經(jīng)標(biāo)定（約0.

14、0100mol/L）的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定各錐形瓶中收集的氨量，直至硼酸指示劑混合液由綠色變回粉紅色，即為滴定終點。分別記下標(biāo)定含有大豆粉消化液用去鹽酸的體積Vx和標(biāo)定空白樣所用去的鹽酸體積V0。六計算（一）計算方法    式中:Vx為滴定樣品用去的鹽酸平均毫升數(shù)，V0為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數(shù)，m0為稱量樣品的質(zhì)量，C為鹽酸的摩爾濃度，14為氮的原子量(lmLO.01mol/L鹽酸相當(dāng)于0.14mg氮)，6.25為系數(shù)，25為樣品的稀釋倍數(shù)。（二）實驗數(shù)據(jù)與結(jié)果計算No.m0(g)C(mol/L)Vx(mL)Vxa(mL)V0(mL)Pr(%)1 &#

15、160;    2 3 4 5 6 7 8 9 10 參考數(shù)值 三.氨基酸高效液相色譜分析一實驗原理首先對大豆樣品進行酸水解制備氨基酸,方法是對氨基酸進行衍生化反應(yīng)，使用高效液相色譜分離所得的衍生物然后以紫外/可見或熒光檢測器作定量分析。本方法適用于一級、二級氨基酸的定量分析。二大豆樣品酸水解液的制備取標(biāo)準(zhǔn)精磨大豆粉20mg,加到2mL的安瓶中,再加入2mL6mol/L的鹽酸溶液,封口后放置于110烤箱中，進行封管酸水解。24h后打破安瓶，將酸水解液轉(zhuǎn)移到

16、蒸發(fā)皿中，于沸水浴上蒸干時可加少量蒸餾水，再次蒸發(fā)，重復(fù)3-4次。三衍生化反應(yīng)OPA-鄰苯二甲醛在常溫下可迅速（約30s）同一級氨基酸發(fā)生定量反應(yīng)生成有較強熒光和紫外吸收的異吲哚衍生物。該反應(yīng)不能用于脯氨酸的分析。氯甲酸戊甲酯（FMOC-CL）可與脯氨酸反應(yīng)生成的衍生物可用于紫外吸收與熒光檢測。OPA和FMOC-CL聯(lián)用的衍生化法不受水和鹽類的干擾，重現(xiàn)性好。四 高壓液相色譜分析高壓液相色譜分析（HPLC）是生命科學(xué)中最有效的分析分離技術(shù)，它是在經(jīng)典柱色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的儀器化液柱色譜。流動相在高壓輸液泵的驅(qū)動下，在色譜柱中與高分離效能的固定相作相對運動，由于樣品中不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，因此，這些組分在兩相間反復(fù)多次地進行平衡分配，造成差速遷移而彼此分離。組分依次隨流動相流出色譜柱進入檢測器，在檢測器中利用組分的物理性質(zhì)（如光學(xué)性質(zhì)）或化學(xué)性質(zhì)（如氧化還原性質(zhì)）而被定量出檢測。由記錄儀將組分的保留特性及相對含量以洗脫曲線的形式記錄下來，其出峰時間和峰面積作為各組分定性定量的依據(jù)。高壓液相