從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌試驗方案

1、從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽胞桿菌實驗方案土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定設(shè)計性實驗方案一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動物體中。它們將淀粉 及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動植 物和微生物中，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn) 品之一。淀粉酶種類繁多，特點各異，可應用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加 工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均 有重要價值,如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研口究的一

2、種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應用1。常見產(chǎn)淀粉酶的主要為芽抱桿菌屬。其中的常見產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌菌種有： 地衣芽口 口抱桿菌、枯草芽抱桿菌、蠟樣芽抱桿菌和納豆芽抱桿菌2、凝結(jié)芽抱3。由于芽抱桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細菌，許多為腐生 菌，主要分布于土壤口和植物體表面及水體中4。所以此次實驗從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽抱桿菌。二、實驗目的要求1 . 了解生物分離提純的原理和方法技術(shù) 2.掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的 原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測定的原理和方法4.培養(yǎng)學生的綜合應用微生物實驗方法的能力5.培養(yǎng)學生自行設(shè)計實驗流程、綜

3、合分析問題解決問題和判斷實驗結(jié)果的能力。三、實驗原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進行生長繁殖和生命活 動中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地 說，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表 10 cm 30 cm 的口土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少 5。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離 與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待 分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑 制劑造成只利于該微生物

4、生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不 需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證 是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體 形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種 特征鑒定才能得到。芽抱桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗陽性；不產(chǎn)生呷咪；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營 養(yǎng)體的最高生長溫度大約從25 C到75c以上；最低生長溫度大約5c到45C；生 長最低pH值，從7.58至IJ 2左右；耐鹽范圍從低于2%勺NaCl到25%Na

5、C;l營養(yǎng) 明膠（22C） 7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上?？莶菅勘U菌和地衣芽抱桿菌在糖 發(fā)酵試驗用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代1替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為營養(yǎng)生長的最低限培養(yǎng)基是無維生素的，但含有葡萄糖、 檸檬酸鹽和口一個氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源 6細菌特性1 .繁殖快速：代謝快、繁殖快，四小時增殖10萬倍，標準菌四小時僅可繁殖 6 倍。2 .生命力強：無濕狀態(tài)可耐低溫-60C、耐高溫+280C,耐強酸、耐強堿、抗菌 消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厭氧繁殖）。3 .體積大：體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制有害菌的生長 繁殖。四、實驗材料和用具4.1 土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有

6、機土壤，和生化樓下花壇的有機土壤4.2 營養(yǎng)瓊脂（）:蛋白陳1牛肉膏0.3 氯化鈉0.5 瓊脂1.52.0 蒸 儲水將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸儲水內(nèi)，加入15%R氧化鈉溶液約2mL校正pH至7.27.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3 淀粉牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基（）:可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯 化鈉0.5 瓊脂1.52.0 校正pH至7.27.44.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（）:玉米粉2 黃豆餅粉1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 檸檬酸鈉0.2 硫酸氨0.075（溶解后加）Na2HPO40.2 校正 pH值 7.04.5

7、葡萄糖蛋白陳培養(yǎng)基（V.P試驗用）（%:葡萄糖0.5 蛋白陳0.5 K2HPO4 0.2 校正 pH 7.2 7.44.6 蛋白陳水培養(yǎng)基（呷咪試驗用）（為 :蛋白陳1%氯化鈉0.5% 校正pH7.2 7.44.7 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%:氯化鈉0.5 硫酸鎂（MgS04 7H2O）0.02 磷 酸二氫錢0.1 磷酸氫二鉀0.1 檸檬酸0.5 瓊脂2澳麝香草酚藍溶液4酚紅 試劑校正pH6.8先將鹽類溶解于水中，校正pH,再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混 勻后分裝試管，121c高溫滅菌15min。4.8 配制營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（為:蛋白陳0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調(diào)pH6.8_7.

8、04.9 耐鹽培養(yǎng)基（% :蛋白陳1牛肉膏0.3氯化鈉2瓊脂1.52.0 蒸儲水蛋白陳1牛肉膏0.3 氯化鈉10瓊脂1.52.0 蒸儲水蛋白陳1牛肉膏0.3氯化鈉20瓊脂1.52.0 蒸儲水蛋白陳1牛肉膏0.3 氯化鈉25瓊脂1.52.0 蒸儲水加入15%C氧化鈉溶液約2mL校正pH至7.27.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊 脂溶化。4.10 溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸錢結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%醇；芽抱染色：5%1雀綠溶液，石炭酸復紅液；香柏油、二甲苯 呷咪試驗：乙醴、呷咪試劑V.P.試驗：40% NaOH液、a -奈酚，淀粉酶活力測定：1%3, 5-二硝基水楊酸試劑4.11儀器或其

9、它用具無菌玻璃涂棒無菌吸管接種環(huán)無菌培養(yǎng)皿 土樣 三角瓶燒杯 洗瓶玻棒試管酒精燈擦鏡紙接種環(huán)酒精燈載玻片吸水紙等。2恒溫搖床恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺水浴箱紫外燈照射箱磁 力攪拌器玻璃珠移液管涂布器顯微鏡五、實驗方法及步驟1、初篩方法制菌懸液：兩個土樣分別取5g,放入各自裝有45mL無菌水的三角瓶，振蕩 10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個環(huán)境的土樣裝 1個錐形瓶，共2個，同 時將其分為4組，編號AR加熱篩選有芽抱的菌：將2個錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無菌室里），利用恒 溫水浴裝置100c左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持 15min （制懸液時就應先開始 加熱），制成10-1 g

10、/ml的土壤懸液梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上10-2、 10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1 土壤液，振蕩后靜止0.5min,用無菌的移液 器吸取1mL土壤懸7加入10-2的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復吹吸數(shù)次， 使之充分混勻，即成10-2 土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液加 入編號為10-3的無菌水試管中，混勻后即為10-3 土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為 10-4、10-5 土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。涂布平板 用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul ,對號

11、較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基平板上， 用灼 燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復）。37c下恒溫培養(yǎng)24h0 2、復篩方法11劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進 行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第 1次平行劃線3_4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約 600角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第 1次劃線部分作第2次平行 劃線，再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃 線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于 28_29。C溫 室中培養(yǎng)約20h.o再繼續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純

12、化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種， 另一部分用來做染色實驗。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培 養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩兩標記同一位置同序號標記，一平板分5個區(qū)域,點接重復兩次，在37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h0上述點接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實驗 室，其他置于無菌室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰 性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號，禾I 用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài) 特征不一

13、致的菌落進行編號，然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視 野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對應的菌種劃線接種到 新的營養(yǎng)瓊脂平板上，標記，37c下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進行劃線分離，培養(yǎng)后再 經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進行芽抱染色。篩選出芽抱純種后進行斜 面接種。3革蘭氏染色步驟： 涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸錢結(jié)晶紫染液，染 1分鐘，傾去染液，流水沖 洗至無紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘, 后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酉精進行脫色約15-20秒，后立即用流水 沖洗。復染：滴加番紅染色液，染3-5分鐘，水洗

14、后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。 芽抱染色染色鏡檢： 取37c培養(yǎng)1824h的枯草芽抱桿菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人3 5滴5%1雀綠水溶液。 用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計 算時間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復紅液復染l min ,水洗。 制片干燥后用油鏡觀察。芽抱呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽抱的形狀和位置，查伯杰細菌手冊）4,斜面保存菌種 貼標簽取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口 23cm處。

15、（每種菌接3管，標上相同編號也要與平 板上菌落編號相對應）。進行斜面接種操作，加塞、包扎好到 37c培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h05、菌種的鑒定5.1 所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽抱桿菌 菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài) 、高度、透明程度、邊緣、是否易被挑起、 氣味等。然后進行一系列的鏡檢一一革蘭氏染色、芽抱染色（具體步驟同上）觀 察是否符合附表中芽抱桿菌的指標 5.2生理生化試驗溫度對菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗；溫度對菌種的影響；明膠液化試驗； 糖發(fā)酵試驗；乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗）；呷咪試驗；耐鹽性試驗；檸檬酸鹽利用試驗。溫度對微生物生長的影響將牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基

16、熔化倒平板。（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5到2 倍） 取30套牛肉膏蛋白陳平板，分別進行標號。在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個菌種重復接種六個平板。各取每個菌種兩套平板倒置 于4c （冰箱）、37 C （或者室溫），60c下保溫培養(yǎng)24小時，觀察細菌的生長 狀況。（“一”不生長，“ +”生長較差，“+”生長一般，“ +”生長良好。淀粉水解實驗以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)劃”+ ”字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于 36 1C培養(yǎng)24-48h,或于20c培 養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑 于試管中。立

17、即檢視結(jié)果，陽4性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透 明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環(huán)或肉湯呈深藍色。淀粉水解系逐 步進行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有 淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。 淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。糖類發(fā)酵試驗（葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵）用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒有標簽和標識的另外一端，注意保留標簽和糖的名 稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復兩次，標記， 要與斜面菌種標記相對應。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對

18、照。注意接 種的整個過程中，不能人為的制造氣泡，若發(fā)酵管內(nèi)有氣泡，則輕輕甩動發(fā)酵管 直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應重做一管。接種后，每一管外包 一層無菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小燒杯內(nèi)，37C培養(yǎng)24ho觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結(jié)果為陰性， 表明該菌不能利用該種糖，記錄用”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有 氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用表示；如杜氏小 管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用“一”。乙酰甲基甲醇試驗（V. P試驗）標記試管：取裝有葡萄糖蛋白陳培養(yǎng)液的試管，編號。接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)24h0觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40% NaOH71020滴，并加 等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置 37。叵溫箱中保溫1530min 后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為 V.P.試驗陽性反應（用“ 十 ”表示）；若不呈紅色， 記錄為V.P.試驗陰性反應（用“”表示）。呷珠試驗試管