分子生物學檢查概要

1、分 子 生 物 學 檢 查分子生物學定義 分子生物學（molecular biology)是從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學。它的核心內容是通過生物的物質基礎核酸、蛋白質、酶等生物大分子的結構、功能及其相互作用等運動規(guī)律的研究來闡明生命分子基礎，從而探索生命奧秘分子生物學發(fā)展簡史1871年 Miesscher 首次從萊茵河鮭魚精子中分離到DNA1953年 Watson和rick 闡明DNA雙螺旋結構1958年 Meselson 和Stahl 提出DNA半保留復制模型1965年 發(fā)現(xiàn)質粒1966年 Nirenberg 等破譯全部遺傳密碼1970年 Smith分離到第一種核酸內切限制酶1973年 Bo

2、yer和Cohen 建立DNA重組技術1977年Sanger以及Maxam 和Gilbert 發(fā)明快速DNA測序技術1981年 Palmiter和Brinster成功獲得第一只基因小鼠1985年 PCR方法問世；Watson出任“人類基因組計劃”首席科學家1990年 美國批準第一個體細胞基因治療方案分子生物學發(fā)展簡史1995年 英國“自然”雜志發(fā)表人類基因組全物理圖1997年 英國愛丁堡羅斯林研究所培養(yǎng)出第一只克隆羊多莉1999年 中國正式加入“人類基因組計劃（HGP）”2000年 全部人類基因組測序工作宣告完成，進入 后基因組計劃時代( 基因克隆計劃、基因組多樣性計劃、 cDNA計劃、蛋白質

3、計劃、細胞計劃）分子生物學與現(xiàn)代醫(yī)學一、 分子生物學在發(fā)病機制中的應用 1 阿爾茲海默?。ˋD）的基因定位 2 生物活性多肽及蛋白質mRNA研究 確證腎素血管緊張素系統(tǒng)在遺傳性高血壓發(fā)病中起重要作用 3 對某些病毒致病作用的研究 發(fā)現(xiàn)肝癌細胞DNA整合有HBV-DNA，認為乙肝與肝癌發(fā)病密切相關4 認識了某些遺傳疾病的發(fā)病機制 地中海貧血是 或 基因缺失或點突變所致二、分子生物學在疾病診斷中的作用發(fā)病過程：基因突變-mRNA-蛋白質（激素）-細胞病變-組織器官病變-臨床癥狀根據(jù)基因突變檢測、基因連續(xù)性分析、mRNA檢測三種途徑，使用核酸分子雜交和PCR技術，進行分子生物學檢查，使遺傳性疾病、感

4、染性疾病和腫瘤等的診斷提前到基因和mRNA水平 三、分子生物學在疾病治療中的應用基因治療： 將目的基因加以修飾，轉移到體細胞中，以達到治療作用應用： 單基因遺傳病、腫瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害較大且目前無有效治療途徑的疾病四、重組DNA技術與新藥研究 重組微生物、基因疫苗、細胞因子合成、轉基因動植物等分子生物學的一般原理和研究方法一、核酸的結構和功能1 核酸的一級結構：磷酸二酯鍵連接成的核苷酸鏈 核苷酸：戊糖、磷酸基團、堿基 堿基： DNA：A、 G 、 T 、 C RNA：A、 G 、 U、C核酸是極性分子，5端為磷酸基團，3端為羥基，核酸序列的習慣寫法是 5端 3端核酸的結構

5、和功能2 DNA的二級結構：著名的雙螺旋結構 兩條核苷酸鏈通過堿基間氫鍵相連（AT，CG），走向相反。DNA的變性與復性： 誘導因素：加熱、酸、堿、 乙醇、丙酮、高鹽等 應用：分子雜交的基礎核酸的結構和功能3 DNA的三級結構：DNA雙螺旋和核小體 串珠裝狀的核小體壓縮成螺旋形，進一步折疊成染色單體，DNA長度因此縮短10000倍4 DNA功能 攜帶和傳遞遺傳信息，體現(xiàn)遺傳過程的相對保守性 遺傳的中心法則 DNA RNA 蛋白質復制 轉錄 逆轉錄復制（病毒）翻譯核酸的結構和功能5 DNA的 半保留復制原則核酸的結構和功能6 RNA： rRNA ：組成核糖體 mRNA ：傳遞遺傳信息由核內至胞漿

6、的核糖體 tRNA：轉運氨基酸密碼子：共64個密碼子，有61個用于編碼20個氨基酸，另外還有3個作為終止密碼(UAA、UAG、UGA)二、基因及其表達調控基因：合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。一個基因不僅包括編碼序列，還包括所需的調控序列、5端不翻譯序列、內含子和3非翻譯序列等所有核酸序列基因組： 一個生物體的所有基因。人類指23對染色體中的所有基因基因及其表達調控基因表達調控： 多層次 DNA及染色體水平 轉錄水平 轉錄后水平 翻譯水平 蛋白質加工水平三、人類基因缺陷的主要類型突變 指突變體中DNA結構的任何改變，致使基因作用（結構蛋白、酶等），以致個體表型改變（一）點

7、突變：單個核苷酸的置換（1）同義突變：GAU GAC 均是天門冬氨酸 密碼子（2）錯義突變：翻譯出的氨基酸改變（3）無義突變：產生提前出現(xiàn)的終止密碼子（4）延長突變：終止密碼子突變?yōu)榘被崦艽a子人類基因缺陷的主要類型（二）缺失或插入小的缺失或插入，堿基數(shù)量非3的整倍數(shù)，稱移碼突變，若為3 的整倍數(shù)，出現(xiàn)密碼子的插入或缺失（三）染色體畸變染色體結構發(fā)生大范圍改變：倒位、缺失、插入、易位四、基因工程基因工程 是指在體外的條件下，人工將DNA分子“剪切”并重新“拼接” ，形成一個新的雜合的DNA分子，然后將它導入微生物或真核細胞內進行擴增，使該基因在細胞內高效表達，從而產生人類需要的基因產物或改造、

8、創(chuàng)造新的生物類型基因工程基因工程的基本程序（1）帶有目的基因的 DNA片段的獲得（2）DNA片段與載體 DNA連接（體外重組）（3）連接產物導入 宿主細胞（4）重組體的擴增、 篩選與鑒定（5）目的基因在細胞中 的表達（6）表達產物的分離、 鑒定等基因工程 （一）基因工程的工具酶 限制性核酸內切酶 核酸修飾酶：連接酶、聚合酶、 核酸酶、 堿性磷酸酶等（二）基因工程的宿主細胞和載體 原核細胞：大腸桿菌、枯草桿菌宿主細胞 真核細胞：哺乳動物細胞 大腸桿菌：質粒、 噬菌體衍生載體常用載體 哺乳動物細胞：單鏈噬菌體載體、 逆轉錄病毒、腺病毒 基因工程（三）目的基因的分離 已知基因的獲得：限制性內切酶酶切

9、法 PCR法、RT-PCR法、 人工合成DNA片段法 基因文庫篩選法未知基因的獲得：蛋白質 DNA策略 基因工程（四）目的基因與載體的連接 工具：DNA 連接酶 產物：重組體（五）重組DNA分子導入宿主細胞 轉化：導入細菌 轉染：導入噬菌體、病毒宿主菌必須是限制酶缺陷型和DNA重組缺陷型基因工程（六）重組體的篩選直接篩選法：借助遺傳表型進行篩選 插入失活法：pBR322質粒結合氨芐青霉素（Ap）和四環(huán)素（Tc）抗性基因，插入后失活Tc 插入表達法：pTR262質粒的四環(huán)素抗性（Tcr）基因上游cI基因，插入后cI基因失活，抗性表達（七）克隆基因的表達基因工程 插入失活法篩選重組體示意圖基因診斷

10、一、基因診斷的基本原理 運用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學方法檢測基因結構及其表達功能是否正常，從而對人體狀態(tài)和疾病作出診斷?；蛟\斷檢測的靶物是DNA或mRNA基因診斷二、基因診斷的特點1 高度特異性2 高靈敏度及精確性：PCR方法克檢測出pg級 水平靶基因3 早期快速：結合桿菌培養(yǎng)需幾周，痰涂片染色 陽性率低，PCR方法一個工作日確診4 被測基因不一定處于活化狀態(tài)三、基因診斷的臨床意義1 優(yōu)生優(yōu)育 3 預防醫(yī)學 2 器官移植 4 感染性疾病核酸分子雜交技術定義： 依據(jù)DNA雙鏈堿基互補、變性和復性原理，用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補的同源核酸序列的方法核酸分子

11、雜交技術一、探針的特征和種類探針是一段與被測核苷酸序列互補的帶標記的核苷酸片段特征：1 要加以標記，帶示蹤物 2 單鏈 3 選取基因編碼序列 4 高度特異性 5 長度十幾到幾千堿基 6 標記探針高靈敏度、穩(wěn)定，標記 方法簡便、安全種類：基因組DNA探針、cDNA探針、 寡核苷酸探針、RNA探針 核酸分子雜交技術二、探針的標記物放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物質：生物素、地高辛、熒光素、酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶等）及金屬Hg等三、核酸分子雜交方法液相雜交；固相雜交固相載體：硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠、 磁珠等核酸分子雜交技術雜交基本程序核酸分子雜交

12、技術幾種固相核酸分子雜交方法：1 Southern 印跡雜交法： DNA分子經(jīng)酶切核瓊脂糖凝膠電泳后，放入堿溶液中變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠上吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上用與雜交核酸分子雜交技術2 Northern 印跡雜交法： 經(jīng)典的RNA分析法，類似Southern印跡，主要區(qū)別是在變性劑存在下，以瓊脂糖凝膠電泳分離RNA3 斑點或狹縫雜交4 原位雜交：核酸分子探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交核酸分子雜交技術四、雜交信號的檢測 1 放射自顯影：X光片檢測放射性核素標記物2 非放射性探針檢測：（1）偶聯(lián)（2）顯色：酶促、熒光、化學發(fā)光聚合酶鏈式反應（PCR）1985年 Kary BM

13、 創(chuàng)建了聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ,PCR)技術，又稱體外基因擴增技術，該技術可擴增核酸靶序列，增加106倍，極大提高檢測靈敏度原理：利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模仿體內的復制過程，在附加的一對引物之間誘發(fā)聚合酶反應。PCR全過程由DNA模板變性、模板與引物結合及引物延伸三個步驟組成聚合酶鏈式反應（PCR）PCR反應的原理示意圖1 DNA模板變性2 模板與引物結合3 引物延伸聚合酶鏈式反應（PCR）PCR條件的優(yōu)化1 模板核酸： 來源廣泛、需部分純化、去除DNA聚合酶抑制劑 一般宜用ng級的克隆DNA， g水平的染色體DNA或104拷貝的待擴

14、增模板 用于檢測目的，擴增片段長度一般不超過500bp，以100-300bp為好2 引物應純化，濃度不宜過高一般終濃度為0.2-1.0 mol/L聚合酶鏈式反應（PCR）3 緩沖液目前最常用PCR反應的緩沖液體系為10-50mmol/L Tris-HCl （PH8.3-8.8，20C） 偏堿性有利于Taq DNA聚合酶作用 緩沖液中50mmol/L KCl利于引物退火 Mg2+對產量和特異性有顯著影響，過高特異性下降；過低產量減少。在各種dNTP濃度為200 mol/L時Mg2+為1.5-2.0mmol/L較合適聚合酶鏈式反應（PCR）4 dNTP 濃度 常采用50-200 mol/L的dNT

15、P 4種dNTP濃度要一致5 Taq DNA聚合酶用量 在100 l 總反應液中，一般所需Taq DNA聚合酶用量為0.5-5 U，通常加入2.5 U，足以達到每分鐘延伸1000-4000個核苷酸速度聚合酶鏈式反應（PCR）6 循環(huán)參數(shù)（1）變性溫度與時間 94 C 30s（2）退火溫度與時間 退火溫度決定反應特異性 取決于引物的長度、濃度和堿基組成（G+C含量）。長度為15-25bp時，退火溫度可根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T）（3）延伸溫度與時間 72 C 待擴增片段 1kb，1min；1kb 3-4min（4）循環(huán)次數(shù) 20-25個循環(huán)聚合酶鏈式反應（PCR）PCR擴增產物分析法 （

16、1）凝膠電泳法 （2）點雜交分析結果 （3）微孔板夾心雜交法 （4）PCR-ELISA法限制性片段長度多態(tài)性分析概念： 當DNA序列差異發(fā)生在限制性內切酶的識別位點時，或當DNA片段的插入、缺失或重復致使基因組DNA 經(jīng)限制性內切酶水解發(fā)生片段改變。這種在同種生物不同個體間出現(xiàn)不同長度限制性片段類型，就是限制性片段多態(tài)性（RFLP）限制性片段長度多態(tài)性分析人類基因組存在兩類多態(tài)性：1 限制性內切酶酶切位點改變造成的RFLP2 串聯(lián)重復順序拷貝數(shù)不同造成的多態(tài)性）VNTR）RFLP可用于遺傳病的產前診斷等分子生物學的一般原理和研究方法核酸的結構和功能5 DNA的 半保留復制原則核酸的結構和功能5

17、 DNA的 半保留復制原則四、基因工程基因工程 是指在體外的條件下，人工將DNA分子“剪切”并重新“拼接” ，形成一個新的雜合的DNA分子，然后將它導入微生物或真核細胞內進行擴增，使該基因在細胞內高效表達，從而產生人類需要的基因產物或改造、創(chuàng)造新的生物類型基因工程（三）目的基因的分離 已知基因的獲得：限制性內切酶酶切法 PCR法、RT-PCR法、 人工合成DNA片段法 基因文庫篩選法未知基因的獲得：蛋白質 DNA策略 基因工程（四）目的基因與載體的連接 工具：DNA 連接酶 產物：重組體（五）重組DNA分子導入宿主細胞 轉化：導入細菌 轉染：導入噬菌體、病毒宿主菌必須是限制酶缺陷型和DNA重組缺陷型基因診斷二、基因診斷的特點1 高度