基因工程大腸桿菌克隆載體

1、第三章第二部分第三章第二部分 大腸桿菌的克隆載大腸桿菌的克隆載體體C l o n i n g V e c t o r s f o r E . c o l i所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌所有克隆質(zhì)粒中，最多的一類是以大腸桿菌為宿主的。為宿主的。因?yàn)椋阂驗(yàn)椋?過(guò)去過(guò)去5050年內(nèi)，這種細(xì)菌在基礎(chǔ)研究中一直年內(nèi)，這種細(xì)菌在基礎(chǔ)研究中一直扮演著中心角色；扮演著中心角色； 已積累大量有關(guān)大腸桿菌的微生物學(xué)、生已積累大量有關(guān)大腸桿菌的微生物學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí)；物化學(xué)和遺傳學(xué)知識(shí)； 事實(shí)上所有關(guān)于基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研事實(shí)上所有關(guān)于基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)研究都是以大腸桿菌為材料而開(kāi)展的。究都是

2、以大腸桿菌為材料而開(kāi)展的。3.1 3.1 基于大腸桿菌質(zhì)粒的克隆載體基于大腸桿菌質(zhì)粒的克隆載體基因克隆領(lǐng)域最得到廣泛應(yīng)用的也是最簡(jiǎn)單基因克隆領(lǐng)域最得到廣泛應(yīng)用的也是最簡(jiǎn)單的，是那些以大腸桿菌質(zhì)粒為基礎(chǔ)而構(gòu)建的的，是那些以大腸桿菌質(zhì)粒為基礎(chǔ)而構(gòu)建的克隆載體。克隆載體?？捎糜诖竽c桿菌的有很多不同的質(zhì)粒載體，可用于大腸桿菌的有很多不同的質(zhì)粒載體，其中有很大一部分是由商業(yè)公司提供的。他其中有很大一部分是由商業(yè)公司提供的。他們開(kāi)發(fā)的載體既易于純化，又結(jié)合一些想要們開(kāi)發(fā)的載體既易于純化，又結(jié)合一些想要的特性，如高的轉(zhuǎn)化效率、方便的轉(zhuǎn)化和重的特性，如高的轉(zhuǎn)化效率、方便的轉(zhuǎn)化和重組的篩選標(biāo)志以及克隆相當(dāng)大的組

3、的篩選標(biāo)志以及克隆相當(dāng)大的DNADNA片段片段( (高高達(dá)達(dá)8kb)8kb)的能力。的能力。如：如：pBR322pBR322。pBR322pBR322是最早被構(gòu)建的質(zhì)粒，是最早被構(gòu)建的質(zhì)粒，至今仍被廣泛使用。至今仍被廣泛使用。3.1.1 3.1.1 質(zhì)?？寺≥d體的命名法質(zhì)粒克隆載體的命名法“pBR322pBR322”這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：這個(gè)名字符合載體命名法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則： “p p”說(shuō)明它是一個(gè)質(zhì)粒；說(shuō)明它是一個(gè)質(zhì)粒； “BRBR表示最初構(gòu)建它的實(shí)驗(yàn)室表示最初構(gòu)建它的實(shí)驗(yàn)室(BR(BR代表了兩個(gè)構(gòu)建人的名字：代表了兩個(gè)構(gòu)建人的名字：BolivarBolivar和和Rodriguez

4、)Rodriguez)。 “322322把該質(zhì)粒和該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開(kāi)來(lái)把該質(zhì)粒和該實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的其他質(zhì)粒區(qū)分開(kāi)來(lái)( (另外還另外還有有pBR325pBR325，pBR327pBR327，pBR328pBR3283.1.2 pBR3223.1.2 pBR322的一些有用特性的一些有用特性從從pBR322pBR322的遺傳圖譜和物理圖譜的遺傳圖譜和物理圖譜( (圖圖6-1)6-1)可可以看出為什么它能是一個(gè)如此受歡迎的克隆以看出為什么它能是一個(gè)如此受歡迎的克隆載體？載體？第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它的大小第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它的大小 第第2 2章里提到，作為一個(gè)克隆載體它的大小章里提到，作為一個(gè)克隆載體它的

5、大小應(yīng)該小于應(yīng)該小于10kb10kb，否則在提純它的時(shí)候很容易，否則在提純它的時(shí)候很容易導(dǎo)致導(dǎo)致DNADNA斷裂。斷裂。 pBR322pBR322只有只有4 363bp4 363bp，意味著可以很容易，意味著可以很容易純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組純化質(zhì)粒本身及其所攜帶的重組DNADNA分子。分子。即使添加上即使添加上6kb6kb的的DNADNA鏈，重組的鏈，重組的pBR322pBR322的的大小仍在可操作的范圍內(nèi)。大小仍在可操作的范圍內(nèi)。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是擁有兩套抗生素耐藥性基因兩個(gè)耐藥性基因兩個(gè)耐藥性基因( (氨芐青霉素耐藥性和四環(huán)素氨芐青霉素耐藥性和四環(huán)素耐藥性基因耐藥性基因) )都可作為含有該

6、質(zhì)粒的篩選標(biāo)都可作為含有該質(zhì)粒的篩選標(biāo)志，而且志，而且每個(gè)抗性基因內(nèi)都擁有一個(gè)限制性每個(gè)抗性基因內(nèi)都擁有一個(gè)限制性單酶切位點(diǎn)單酶切位點(diǎn)，這在克隆實(shí)驗(yàn)中非常有用。，這在克隆實(shí)驗(yàn)中非常有用。用用PstPstI I，PuvPuvI I或或ScaScaI I酶切后插入酶切后插入DNADNA會(huì)導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活；用氨芐青霉素抗性基因失活；用BamBamHIHI及及HinHindd等等8 8個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶酶切后插入個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶酶切后插入DNADNA會(huì)導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活。會(huì)導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活。這意味著這意味著pBR322pBR322支持很多種不同黏性末端的支持很多種不同黏性末

7、端的DNADNA片段的導(dǎo)入。片段的導(dǎo)入。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于pBR322pBR322有相當(dāng)高的拷貝數(shù)有相當(dāng)高的拷貝數(shù) 通常在被轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌中有大約通常在被轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌中有大約1515個(gè)個(gè)pBR322pBR322質(zhì)粒分子；質(zhì)粒分子； 在蛋白質(zhì)合成抑制劑在蛋白質(zhì)合成抑制劑( (如氯霉素如氯霉素) )的存在的存在下，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增，拷貝數(shù)可以增加到下，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增，拷貝數(shù)可以增加到1 1 000-3 000000-3 000。 這樣，通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大這樣，通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過(guò)的量重組過(guò)的pBR322pBR322質(zhì)粒分子。質(zhì)粒分子。3.1.3 pBR3223.

8、1.3 pBR322的家譜的家譜pBR322pBR322作為一個(gè)克隆載體的方便性決非偶然，作為一個(gè)克隆載體的方便性決非偶然，它在被設(shè)計(jì)時(shí)就定好了要擁有這些特點(diǎn)。它在被設(shè)計(jì)時(shí)就定好了要擁有這些特點(diǎn)。構(gòu)建構(gòu)建pBR322pBR322的步驟簡(jiǎn)述如圖。的步驟簡(jiǎn)述如圖。它的構(gòu)建是一件曲折而艱巨的操作，用到了它的構(gòu)建是一件曲折而艱巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技術(shù)。全部巧妙的基因操作技術(shù)。pBR322pBR322實(shí)際上由實(shí)際上由3 3個(gè)在自然界存在的天然質(zhì)粒個(gè)在自然界存在的天然質(zhì)粒拼接而成。拼接而成。3.1.4 3.1.4 其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d其他大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體體pBR322pBR322質(zhì)粒是

9、在質(zhì)粒是在2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代后期被構(gòu)建出來(lái)的，第一份描述它年代后期被構(gòu)建出來(lái)的，第一份描述它的用途的論文在的用途的論文在19771977發(fā)表。發(fā)表。從那以后，人們構(gòu)建了大量其他的質(zhì)?？寺≥d體，它們大多數(shù)只從那以后，人們構(gòu)建了大量其他的質(zhì)?？寺≥d體，它們大多數(shù)只是對(duì)是對(duì)pBR322pBR322作了少量修改。作了少量修改。pBR327pBR327一個(gè)高拷貝數(shù)質(zhì)粒一個(gè)高拷貝數(shù)質(zhì)粒pBR327pBR327通過(guò)從通過(guò)從pBR322pBR322中移除一個(gè)長(zhǎng)中移除一個(gè)長(zhǎng)1 089bp1 089bp的片段而構(gòu)建。片段的刪除并沒(méi)有損傷的片段而構(gòu)建。片段的刪除并沒(méi)有損傷ampampR R和和terter

10、R R這兩個(gè)抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復(fù)這兩個(gè)抗性基因，但改變了質(zhì)粒的復(fù)制能力和接合能力。制能力和接合能力。pBR327pBR327與與pBR322pBR322有兩點(diǎn)重要的不同有兩點(diǎn)重要的不同 (1)pBR327(1)pBR327的拷貝數(shù)比的拷貝數(shù)比pBR322pBR322更高更高。每個(gè)大腸桿菌中可以存在每個(gè)大腸桿菌中可以存在30-4530-45個(gè)質(zhì)粒分子。個(gè)質(zhì)粒分子。當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究被克隆的基因功能的時(shí)當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究被克隆的基因功能的時(shí)候，有更高拷貝數(shù)的候，有更高拷貝數(shù)的pBR327pBR327就更適合于用就更適合于用作載體。作載體?？截悢?shù)越高，被克隆的基因在細(xì)胞中所產(chǎn)生拷貝數(shù)越高，被克

11、隆的基因在細(xì)胞中所產(chǎn)生的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。的效果就越容易被發(fā)現(xiàn)。(2)1 089bp(2)1 089bp片段的刪除，破壞了片段的刪除，破壞了pBR322pBR322的接的接合能力，使合能力，使pBR327pBR327不能把自己轉(zhuǎn)移到另外不能把自己轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中去一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中去。這一點(diǎn)對(duì)生物防范很重要，避免了粗心的生這一點(diǎn)對(duì)生物防范很重要，避免了粗心的生物學(xué)家使重組后的質(zhì)粒從試管和細(xì)菌植株中物學(xué)家使重組后的質(zhì)粒從試管和細(xì)菌植株中逸出。逸出。相反，相反，pBR322pBR322在理論上可以通過(guò)結(jié)合而進(jìn)入在理論上可以通過(guò)結(jié)合而進(jìn)入天然的大腸桿菌細(xì)胞中去，雖然事實(shí)上天然的大腸桿菌

12、細(xì)胞中去，雖然事實(shí)上pBR322pBR322也有一定的安全措施減少這種情況也有一定的安全措施減少這種情況的發(fā)生。的發(fā)生。當(dāng)被克隆的基因有潛在的危害性時(shí)，應(yīng)優(yōu)先當(dāng)被克隆的基因有潛在的危害性時(shí)，應(yīng)優(yōu)先選擇選擇pBR327pBR327。pUC8pUC8乳糖選擇質(zhì)粒乳糖選擇質(zhì)粒pUC8pUC8也是一個(gè)源自于也是一個(gè)源自于pBR322pBR322的質(zhì)粒，的質(zhì)粒，只保留了只保留了pBR322pBR322的復(fù)制起點(diǎn)和的復(fù)制起點(diǎn)和ampampR R基因?；颉mpampR R基因的核酸序列也被改變了，不再包含基因的核酸序列也被改變了，不再包含唯一的限制性酶切位點(diǎn)。唯一的限制性酶切位點(diǎn)。所有這些位點(diǎn)被集中到所

13、有這些位點(diǎn)被集中到pUC8pUC8所攜帶的所攜帶的lacZlacZ 基因中的一小段序列上?；蛑械囊恍《涡蛄猩稀?pUC8pUC8所擁有的所擁有的3 3個(gè)優(yōu)點(diǎn)使它成為最受歡迎的大個(gè)優(yōu)點(diǎn)使它成為最受歡迎的大腸桿菌克隆載體之一。腸桿菌克隆載體之一。第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)人們?cè)跇?gòu)建這個(gè)質(zhì)粒時(shí)，在它的復(fù)制起點(diǎn)上人們?cè)跇?gòu)建這個(gè)質(zhì)粒時(shí)，在它的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生了一個(gè)偶然的突變，使得它在大腸桿菌產(chǎn)生了一個(gè)偶然的突變，使得它在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)達(dá)到了內(nèi)的拷貝數(shù)達(dá)到了500-700500-700（擴(kuò)增以前的數(shù)（擴(kuò)增以前的數(shù)目）。目）。這樣可以在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中獲得大這樣可以在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌細(xì)胞中獲得大量的目的

14、量的目的DNADNA。第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于重組體的識(shí)別只需一步，僅在于重組體的識(shí)別只需一步，僅僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐僅只要把待篩選的大腸桿菌鋪板到含有氨芐青霉素和青霉素和X-galX-gal的瓊脂培養(yǎng)基上。的瓊脂培養(yǎng)基上。而而pBR322pBR322和和pBR327pBR327，重組體的篩選都需要把，重組體的篩選都需要把菌落從一種抗生素培養(yǎng)基原樣轉(zhuǎn)移到另一種菌落從一種抗生素培養(yǎng)基原樣轉(zhuǎn)移到另一種抗生素培養(yǎng)基平板。抗生素培養(yǎng)基平板。一個(gè)用一個(gè)用pUC8pUC8做載體的克隆實(shí)驗(yàn)比選擇做載體的克隆實(shí)驗(yàn)比選擇pBR322pBR322和和pBR327pBR327要節(jié)約一半的時(shí)間。要節(jié)

15、約一半的時(shí)間。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是是pUC8pUC8擁有擁有多克隆單酶切位點(diǎn)多克隆單酶切位點(diǎn)，這使有兩個(gè)不同黏性末端的這使有兩個(gè)不同黏性末端的DNADNA片段片段( (比如一比如一端是被端是被EcoEcoRIRI酶切過(guò)的，另一端是被酶切過(guò)的，另一端是被BamBamHIHI酶切過(guò)的酶切過(guò)的) )可以直接被克隆，而不需求助于可以直接被克隆，而不需求助于加入連接片段的操作。加入連接片段的操作。其他的其他的pUCpUC載體，載體，擁有不同的限制性酶切位點(diǎn)，擁有不同的限制性酶切位點(diǎn)，具有更大的靈活性，允許更多種不同的具有更大的靈活性，允許更多種不同的DNADNA片段被克隆。片段被克隆。此外，這些載體中

16、的限制性酶切位點(diǎn)與存在此外，這些載體中的限制性酶切位點(diǎn)與存在于于M13mp M13mp 系列載體中的限制性酶切位點(diǎn)一系列載體中的限制性酶切位點(diǎn)一樣，可以很方便的進(jìn)行樣，可以很方便的進(jìn)行DNADNA測(cè)序或體外誘變。測(cè)序或體外誘變。pGEM3ZpGEM3Z克隆克隆DNADNA的體外轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3ZpGEM3Z與與pUCpUC載體很相似：都含有載體很相似：都含有ampampR R和和lacZlacZ基因，在后者上有一個(gè)限制性酶切位基因，在后者上有一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，而且兩個(gè)質(zhì)粒有著差不多完全相同的大點(diǎn)，而且兩個(gè)質(zhì)粒有著差不多完全相同的大小。小。區(qū)別：區(qū)別：pGEM3ZpGEM3Z多兩個(gè)短片

17、段，每一個(gè)片段都多兩個(gè)短片段，每一個(gè)片段都可以充當(dāng)啟動(dòng)子，黏附可以充當(dāng)啟動(dòng)子，黏附RNARNA聚合酶。聚合酶。外源外源DNADNA在限制性酶切位點(diǎn)被導(dǎo)入在限制性酶切位點(diǎn)被導(dǎo)入pGEM3ZpGEM3Z載載體，在限制性酶切位點(diǎn)的兩邊分別存在著這體，在限制性酶切位點(diǎn)的兩邊分別存在著這兩個(gè)啟動(dòng)子序列。這就意味著，在試管里同兩個(gè)啟動(dòng)子序列。這就意味著，在試管里同時(shí)放入重組后的時(shí)放入重組后的pGEM3ZpGEM3Z質(zhì)粒和提純的質(zhì)粒和提純的RNARNA聚聚合酶，被克隆的合酶，被克隆的DNADNA分子會(huì)指導(dǎo)合成相應(yīng)的分子會(huì)指導(dǎo)合成相應(yīng)的RNARNA，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的RNARNA可用作雜交探可

18、用作雜交探針，也可用于研究針，也可用于研究RNARNA加工加工 ( (如內(nèi)含子如何如內(nèi)含子如何切除切除) )，或是用于合成蛋白質(zhì)。，或是用于合成蛋白質(zhì)。被被pGEM3ZpGEM3Z和其他同類載體所攜帶的啟動(dòng)子并和其他同類載體所攜帶的啟動(dòng)子并不是被大腸桿菌不是被大腸桿菌RNARNA聚合酶識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)聚合酶識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)子。子。實(shí)際上這些啟動(dòng)子有的被實(shí)際上這些啟動(dòng)子有的被T7T7噬菌體編碼的噬菌體編碼的RNARNA聚合酶專一性識(shí)別，有的被聚合酶專一性識(shí)別，有的被SP6SP6噬菌體編碼噬菌體編碼的的RNARNA聚合酶專一性識(shí)別。聚合酶專一性識(shí)別。當(dāng)大腸桿菌被其中某種噬菌體侵染時(shí)就合成當(dāng)大腸桿菌被其

19、中某種噬菌體侵染時(shí)就合成這些這些RNARNA聚合酶，用以轉(zhuǎn)錄噬菌體基因。聚合酶，用以轉(zhuǎn)錄噬菌體基因。之所以在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中選擇病毒之所以在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中選擇病毒RNARNA聚合酶，聚合酶，是因?yàn)樗鼈冇兄喈?dāng)高的酶活，因此噬菌體是因?yàn)樗鼈冇兄喈?dāng)高的酶活，因此噬菌體基因一定能夠很快被轉(zhuǎn)錄出來(lái)，能夠在每分基因一定能夠很快被轉(zhuǎn)錄出來(lái)，能夠在每分鐘合成鐘合成1-21-2g gRNARNA，比標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌，比標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌RNARNA聚聚合酶高效得多。合酶高效得多。3.2 3.2 基于基于M3M3噬菌體的克隆載體噬菌體的克隆載體對(duì)任何克隆載體而言，最基本的要求是能夠?qū)θ魏慰寺≥d體而言，最基本的要求是能

20、夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。質(zhì)粒載體很容易滿足這個(gè)要求質(zhì)粒載體很容易滿足這個(gè)要求首先它有一個(gè)短的首先它有一個(gè)短的DNADNA序列能夠充當(dāng)復(fù)制起點(diǎn)，序列能夠充當(dāng)復(fù)制起點(diǎn)，并且它復(fù)制所需要的酶也可以全部或大部分并且它復(fù)制所需要的酶也可以全部或大部分從宿主細(xì)胞獲得。從宿主細(xì)胞獲得。精密的構(gòu)建操作，使最終形成的質(zhì)粒載體如精密的構(gòu)建操作，使最終形成的質(zhì)粒載體如pBR322pBR322成為一個(gè)完整而具備功能的復(fù)制子。成為一個(gè)完整而具備功能的復(fù)制子。噬菌體，如噬菌體，如M13M13的復(fù)制情況的復(fù)制情況就較為復(fù)雜。就較為復(fù)雜。噬菌體的噬菌體的DNADNA分子通常帶有幾個(gè)為復(fù)制所必需分子通常帶

21、有幾個(gè)為復(fù)制所必需的基因，包括編碼噬菌體蛋白外殼的組分的的基因，包括編碼噬菌體蛋白外殼的組分的基因和編碼噬菌體特有的復(fù)制酶的基因。基因和編碼噬菌體特有的復(fù)制酶的基因。改變或是刪除這些必需基因中的任一個(gè)，都改變或是刪除這些必需基因中的任一個(gè)，都會(huì)損傷或是毀壞噬菌體的復(fù)制能力。會(huì)損傷或是毀壞噬菌體的復(fù)制能力。因此可供改變噬菌體因此可供改變噬菌體DNADNA分子的自由度很小，分子的自由度很小，而而通常的噬菌體載體與原始分子的差別很小通常的噬菌體載體與原始分子的差別很小。以以M13M13噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆噬菌體為例，可以看出構(gòu)建噬菌體克隆載體的難度。載體的難度。一個(gè)正常的一個(gè)正常的M1

22、3M13噬菌體的基因組是噬菌體的基因組是6.4kb6.4kb，為，為緊緊擠在一起的緊緊擠在一起的1010個(gè)基因所占據(jù)，每一個(gè)基個(gè)基因所占據(jù)，每一個(gè)基因?qū)κ删w的復(fù)制都是必需的。在基因間只因?qū)κ删w的復(fù)制都是必需的。在基因間只有一個(gè)僅長(zhǎng)有一個(gè)僅長(zhǎng)507bp507bp的短序列，新的的短序列，新的DNADNA必須必須從這里插入才不會(huì)損傷其他基因，還必須保從這里插入才不會(huì)損傷其他基因，還必須保證同樣處在這個(gè)短序列中的復(fù)制起點(diǎn)不被破證同樣處在這個(gè)短序列中的復(fù)制起點(diǎn)不被破壞。壞。所以，只有一個(gè)很小的空間用于改造所以，只有一個(gè)很小的空間用于改造M13M13噬菌噬菌體。體。然而，然而，M13M13有一個(gè)很吸引

23、人的優(yōu)點(diǎn)：它使人們有一個(gè)很吸引人的優(yōu)點(diǎn)：它使人們可以獲得單鏈的被克隆可以獲得單鏈的被克隆DNADNA。3.2.1 M13mp23.2.1 M13mp2克隆載體的開(kāi)發(fā)克隆載體的開(kāi)發(fā)構(gòu)建構(gòu)建M13M13克隆載體第一步，是把克隆載體第一步，是把lacZlacZ 基因?qū)Щ驅(qū)氲绞删w入到噬菌體M13M13的短序列中。產(chǎn)生了的短序列中。產(chǎn)生了M13mplM13mpl，它在含有它在含有X-galX-gal的瓊脂板上形成藍(lán)色的噬菌的瓊脂板上形成藍(lán)色的噬菌斑。斑。M13mplM13mpl的的lacZlacZ 基因上不含有任何的限制性基因上不含有任何的限制性酶切位點(diǎn)，但在靠近基因起始位置的地方有酶切位點(diǎn)，但在

24、靠近基因起始位置的地方有一個(gè)一個(gè)GGATTCGGATTC的序列。改變一個(gè)核苷酸就變的序列。改變一個(gè)核苷酸就變成成GAATTCGAATTC，這是，這是EcoEcoRIRI的識(shí)別位點(diǎn)。這個(gè)改的識(shí)別位點(diǎn)。這個(gè)改變是用體外誘變完成的，產(chǎn)生了變是用體外誘變完成的，產(chǎn)生了M13mp2M13mp2克克隆載體。隆載體。M13mp2M13mp2有一個(gè)稍稍改變的有一個(gè)稍稍改變的lacZlacZ 基因基因( (第六個(gè)第六個(gè)密碼子編碼天冬氨酰而不是天冬氨酸密碼子編碼天冬氨酰而不是天冬氨酸) )，但，但轉(zhuǎn)染了轉(zhuǎn)染了M13mp2M13mp2的細(xì)胞產(chǎn)生的的細(xì)胞產(chǎn)生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶仍然有著正常的功能。仍然有著正常的功

25、能。 M13mp2M13mp2是最簡(jiǎn)單的是最簡(jiǎn)單的M13M13克隆載體克隆載體。有。有EcoEcoRIRI黏黏性末端的性末端的DNADNA片段可以插入進(jìn)克隆位點(diǎn)，重片段可以插入進(jìn)克隆位點(diǎn)，重組體可以通過(guò)在組體可以通過(guò)在X-galX-gal培養(yǎng)基上的噬菌斑得培養(yǎng)基上的噬菌斑得到識(shí)別。到識(shí)別。3.2.2 M13mp73.2.2 M13mp7對(duì)稱的克隆位點(diǎn)對(duì)稱的克隆位點(diǎn)開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)M13M13克隆載體的下一步是在克隆載體的下一步是在lacZlacZ 基因上基因上添加額外的酶切位點(diǎn)。添加額外的酶切位點(diǎn)。通過(guò)在試管中合成一個(gè)叫做多接頭通過(guò)在試管中合成一個(gè)叫做多接頭(polylinker)的寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。的

26、寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)。多接頭包含一系列的限制性酶切位點(diǎn)，有一多接頭包含一系列的限制性酶切位點(diǎn)，有一個(gè)個(gè)EcoEcoRIRI的黏性末端。的黏性末端。多接頭被插入到多接頭被插入到M13mp2M13mp2克隆載體的克隆載體的EcoEcoRIRI位位點(diǎn)上，形成了一個(gè)更加復(fù)雜的載體，即點(diǎn)上，形成了一個(gè)更加復(fù)雜的載體，即M13mp7M13mp7。 M13mp7M13mp7有有4 4個(gè)可能的克隆位點(diǎn)：個(gè)可能的克隆位點(diǎn)： EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I和和PstPstI I。為了不完全破壞掉為了不完全破壞掉lacZlacZ基因，在設(shè)計(jì)這個(gè)多基因，在設(shè)計(jì)這個(gè)多接頭時(shí)，人們使得讀碼框在通

27、過(guò)多接頭后沒(méi)接頭時(shí)，人們使得讀碼框在通過(guò)多接頭后沒(méi)發(fā)生改變。發(fā)生改變。這樣，產(chǎn)生的這樣，產(chǎn)生的-半乳糖苷酶雖然被改變了序半乳糖苷酶雖然被改變了序列，但仍然有著正常的功能。列，但仍然有著正常的功能。 用用EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I中的任意一種去酶解中的任意一種去酶解M13mp7M13mp7，整個(gè)多接頭或其一部分會(huì)被切掉。，整個(gè)多接頭或其一部分會(huì)被切掉。在其他在其他DNADNA存在下，有存在下，有3 3種連接可能發(fā)生：種連接可能發(fā)生： (1)(1)插入的新插入的新DNADNA， (2)(2)插入的多接頭。插入的多接頭。 (3)(3)載體自連。載體自連。新新DNA

28、DNA的插入會(huì)阻礙的插入會(huì)阻礙-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，半乳糖苷酶的產(chǎn)生，因此重組體在含因此重組體在含X-galX-gal的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生的瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生無(wú)色透明的噬菌斑。無(wú)色透明的噬菌斑。當(dāng)插入的片段是多接頭時(shí)，原來(lái)的當(dāng)插入的片段是多接頭時(shí)，原來(lái)的M13mp7M13mp7載載體又再次形成了，噬茵斑是藍(lán)色的。體又再次形成了，噬茵斑是藍(lán)色的。如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色? ? 多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計(jì)：不管用哪多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計(jì)：不管用哪一個(gè)內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會(huì)連成有功一個(gè)內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會(huì)連成有功能的能的lacZlacZ 基因，

29、最終形成藍(lán)色的噬菌斑?；颍罱K形成藍(lán)色的噬菌斑。因此因此，只有重組體產(chǎn)生無(wú)色透明的噬茵斑。只有重組體產(chǎn)生無(wú)色透明的噬茵斑。由于攜帶對(duì)稱的克隆位點(diǎn)，無(wú)論新的由于攜帶對(duì)稱的克隆位點(diǎn)，無(wú)論新的DNADNA是通過(guò)是通過(guò)BamBamHIHI，SalSalI I或或PstPstI I中的哪一個(gè)酶中的哪一個(gè)酶切位點(diǎn)插入載體，都可以用切位點(diǎn)插入載體，都可以用EcoEcoRIRI從重組從重組后的分子中切除。后的分子中切除。3.2.3 3.2.3 更復(fù)雜的更復(fù)雜的M13M13載體載體越精巧的越精巧的M13M13載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZlacZ 基因中。基因中。M13mp8

30、M13mp8：它是它是pUC8pUC8的對(duì)應(yīng)物。和的對(duì)應(yīng)物。和pUC8pUC8一樣，一樣，它允許插入有不同的兩個(gè)黏性末端的它允許插入有不同的兩個(gè)黏性末端的DNADNA片片段。段。M13mp8M13mp8姐妹載體姐妹載體M13mp9M13mp9有一個(gè)相同的多接頭，有一個(gè)相同的多接頭，但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)把一個(gè)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)把一個(gè)DNADNA片段克隆進(jìn)片段克隆進(jìn)M13mp8M13mp8后，后，可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來(lái)，然可以用兩種限制性內(nèi)切酶把它再切下來(lái)，然后把它連入后把它連入M13mp9M13mp9，那么這片段在載體中，那么

31、這片段在載體中就有了相反的方向。就有了相反的方向。這個(gè)特點(diǎn)在這個(gè)特點(diǎn)在DNADNA測(cè)序中很重要，因?yàn)楹塑账嵝驕y(cè)序中很重要，因?yàn)楹塑账嵝蛄袕亩嘟宇^的末端一直讀進(jìn)插入的列從多接頭的末端一直讀進(jìn)插入的DNADNA片段。片段。通常通常從測(cè)序?qū)嶒?yàn)中只能讀出約從測(cè)序?qū)嶒?yàn)中只能讀出約600600個(gè)堿基個(gè)堿基，如，如果插入的果插入的DNADNA超過(guò)這個(gè)長(zhǎng)度，就有一個(gè)末端超過(guò)這個(gè)長(zhǎng)度，就有一個(gè)末端的序列讀不出來(lái)。的序列讀不出來(lái)。一種解決的方法就是一種解決的方法就是把把DNADNA換個(gè)方向，再插入換個(gè)方向，再插入到姐妹載體中到姐妹載體中。用這個(gè)新得到的克隆，測(cè)序。用這個(gè)新得到的克隆，測(cè)序?qū)嶒?yàn)就可以得到另一端的序列

32、。實(shí)驗(yàn)就可以得到另一端的序列。還有其他的還有其他的M13M13載體可成對(duì)選擇使用。載體可成對(duì)選擇使用。與與M13mp8/9M13mp8/9很相似的有：很相似的有： M13mplO/11M13mplO/11； M13mpl8/19M13mpl8/19；但是它們有不同的多接頭，即，有不同的限但是它們有不同的多接頭，即，有不同的限制性酶切位點(diǎn)。制性酶切位點(diǎn)。3.2.4 M133.2.4 M13和質(zhì)粒的雜交載體和質(zhì)粒的雜交載體盡管盡管M13M13可以產(chǎn)生單鏈可以產(chǎn)生單鏈DNADNA，這使它顯得非常，這使它顯得非常有用，但它有很大一個(gè)缺點(diǎn)。有用，但它有很大一個(gè)缺點(diǎn)。用用M13M13作載體時(shí)，可以容納的作

33、載體時(shí)，可以容納的DNADNA片段大小非片段大小非常有限，通常認(rèn)為常有限，通常認(rèn)為100bp100bp是上限，特殊情況是上限，特殊情況下克隆的片段長(zhǎng)度可達(dá)下克隆的片段長(zhǎng)度可達(dá)1kb1kb。為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們把為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們把M13M13基因組的一部基因組的一部分和質(zhì)粒分和質(zhì)粒DNADNA結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種新型的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒的載體，叫做噬菌體質(zhì)粒(plagemids)。pEMBL8pEMBL8是一個(gè)噬菌體質(zhì)粒是一個(gè)噬菌體質(zhì)粒：通過(guò)把通過(guò)把M13M13基因組中一個(gè)基因組中一個(gè)1 300bp1 300bp的片段導(dǎo)入的片段導(dǎo)入pUC8pUC8中而構(gòu)建。

34、中而構(gòu)建。M13M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈雙鏈DNADNA變成單鏈變成單鏈DNADNA，而被導(dǎo)入的那一段，而被導(dǎo)入的那一段M13 DNAM13 DNA則含有被這種酶識(shí)別的信號(hào)序列。則含有被這種酶識(shí)別的信號(hào)序列。雖然這段序列從雖然這段序列從M13M13的基因組中被分離出來(lái)，的基因組中被分離出來(lái)，但功能仍然還在。但功能仍然還在。所以，所以，pEMBL8pEMBL8也可以被轉(zhuǎn)化成單鏈的也可以被轉(zhuǎn)化成單鏈的DNADNA，并能以有缺陷的噬菌體顆粒的形式被分泌出并能以有缺陷的噬菌體顆粒的形式被分泌出來(lái)。用作來(lái)。用作pEMBL8pEMBL8克隆實(shí)驗(yàn)的宿

35、主大腸桿菌克隆實(shí)驗(yàn)的宿主大腸桿菌必須隨后被正常的必須隨后被正常的M13M13噬菌體感染。正常的噬菌體感染。正常的M13M13噬菌體是作為噬菌體是作為輔助噬菌體輔助噬菌體(helper phage)，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。pEMBL8pEMBL8由于是從由于是從pUC8pUC8發(fā)展來(lái)的，同樣也有插發(fā)展來(lái)的，同樣也有插入多接頭的入多接頭的lacZlacZ基因，重組體可以通過(guò)在基因，重組體可以通過(guò)在含有含有X-galX-gal的培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出的培養(yǎng)基上的噬菌斑而被鑒定出來(lái)。來(lái)?？梢杂每梢杂胮EMBL8pEMBL8產(chǎn)生長(zhǎng)度達(dá)到產(chǎn)生長(zhǎng)度達(dá)到10kb10

36、kb的單鏈的單鏈DNADNA片段，這極大地?cái)U(kuò)展了片段，這極大地?cái)U(kuò)展了M13M13克隆系統(tǒng)的使用克隆系統(tǒng)的使用范范圍。3.3 基于基于噬菌體的克隆載體噬菌體的克隆載體基于基于噬菌體構(gòu)建克隆載體時(shí)，必須解決兩噬菌體構(gòu)建克隆載體時(shí)，必須解決兩個(gè)難題：個(gè)難題：(1)(1)噬菌體的噬菌體的DNADNA分子僅能再增加分子僅能再增加5 5，即，即新新增加的增加的DNADNA長(zhǎng)度不能超過(guò)長(zhǎng)度不能超過(guò)3kb3kb。一旦。一旦DNADNA的總的總長(zhǎng)超過(guò)了長(zhǎng)超過(guò)了52kb52kb，不能包裝進(jìn)入噬菌體的頭部，不能包裝進(jìn)入噬菌體的頭部，也就不能形成感染性的病毒顆粒。這嚴(yán)重制也就不能形成感染性的病毒顆粒。這嚴(yán)重制約了插入

37、約了插入DNADNA片段的長(zhǎng)度，限制了片段的長(zhǎng)度，限制了噬菌體噬菌體載體的使用。載體的使用。(2)(2)噬菌體基因組很大，對(duì)于幾乎每一種限噬菌體基因組很大，對(duì)于幾乎每一種限制性制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)都不是單一的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)都不是單一的。所以，。所以，無(wú)法按我們的需要去酶切和按順序重新裝成無(wú)法按我們的需要去酶切和按順序重新裝成有功能的基因組。有功能的基因組。3.3.1 3.3.1 從從噬菌體基因組移除部分片噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力段而不損傷其生存能力發(fā)現(xiàn)：一個(gè)大的發(fā)現(xiàn)：一個(gè)大的DNADNA片段可以刪除。片段可以刪除。該片段位于該片段位于DNADNA的中部，刪除后并不影響噬的中部，

38、刪除后并不影響噬菌體侵染大腸桿菌的能力。菌體侵染大腸桿菌的能力。去掉這個(gè)非必需片段，可以減小去掉這個(gè)非必需片段，可以減小15kb15kb。即，。即，可以在噬菌體包裝前加入可以在噬菌體包裝前加入18kb18kb的外源的外源DNADNA。這一段非必需片段實(shí)際上包含一些基因，它這一段非必需片段實(shí)際上包含一些基因，它們和們和噬菌體整合與脫離大腸桿菌染色體相噬菌體整合與脫離大腸桿菌染色體相關(guān)。關(guān)。刪除掉這一部分，刪除掉這一部分，噬菌體成為一個(gè)非溶源噬菌體成為一個(gè)非溶源性的噬菌體，進(jìn)行裂解循環(huán)。這樣無(wú)需誘導(dǎo)性的噬菌體，進(jìn)行裂解循環(huán)。這樣無(wú)需誘導(dǎo)就可以形成噬菌斑，這對(duì)于一個(gè)克隆載體來(lái)就可以形成噬菌斑，這對(duì)于

39、一個(gè)克隆載體來(lái)說(shuō)本身就是一個(gè)理想的特點(diǎn)。說(shuō)本身就是一個(gè)理想的特點(diǎn)。3.3.2 用自然選擇來(lái)篩選那些缺少酶用自然選擇來(lái)篩選那些缺少酶切位點(diǎn)的切位點(diǎn)的噬菌體噬菌體即使從即使從噬菌體基因組中移掉那個(gè)大片段，噬菌體基因組中移掉那個(gè)大片段，對(duì)于大多數(shù)內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)還是有太多的識(shí)別位對(duì)于大多數(shù)內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)還是有太多的識(shí)別位點(diǎn)。點(diǎn)。如果僅僅要移除一兩個(gè)這樣的識(shí)別位點(diǎn)，我如果僅僅要移除一兩個(gè)這樣的識(shí)別位點(diǎn)，我們可以通過(guò)體外突變來(lái)解決。們可以通過(guò)體外突變來(lái)解決。例如，想要去掉一個(gè)例如，想要去掉一個(gè)EcoEcoRIRI的位點(diǎn)的位點(diǎn)GAATTCGAATTC，可以把它突變成可以把它突變成GGATTCGGATTC，不會(huì)被，不

40、會(huì)被EcoEcoRIRI切開(kāi)。切開(kāi)。但是，即使現(xiàn)在，要想改變一個(gè)但是，即使現(xiàn)在，要想改變一個(gè)DNADNA分子上的分子上的好幾個(gè)位點(diǎn)，體外突變?nèi)圆皇且粋€(gè)有效方法。好幾個(gè)位點(diǎn)，體外突變?nèi)圆皇且粋€(gè)有效方法。實(shí)際上，可以用自然選擇來(lái)選出那些缺少不實(shí)際上，可以用自然選擇來(lái)選出那些缺少不需要的酶切位點(diǎn)的需要的酶切位點(diǎn)的噬菌體。噬菌體。選用可以產(chǎn)生選用可以產(chǎn)生EcoEcoRIRI的大腸桿菌做寄主，這樣的大腸桿菌做寄主，這樣大多數(shù)的噬菌體大多數(shù)的噬菌體DNADNA就被酶解掉了，但有少就被酶解掉了，但有少量的幸存者并產(chǎn)生了噬菌斑。量的幸存者并產(chǎn)生了噬菌斑。這些突變這些突變噬菌體缺少一個(gè)或者好幾個(gè)噬菌體缺少一個(gè)或

41、者好幾個(gè)EcoEcoRIRI識(shí)別位點(diǎn)。識(shí)別位點(diǎn)。幾個(gè)這樣的感染循環(huán)過(guò)后，得到的幾個(gè)這樣的感染循環(huán)過(guò)后，得到的噬菌體噬菌體是缺失全部或大多數(shù)是缺失全部或大多數(shù)EcoEcoRIRI位點(diǎn)的突變體。位點(diǎn)的突變體。3.3.3 3.3.3 插入載體和置換載體插入載體和置換載體解決包裝限制和多酶切位點(diǎn)的問(wèn)題后，就可以著手開(kāi)發(fā)各種基于解決包裝限制和多酶切位點(diǎn)的問(wèn)題后，就可以著手開(kāi)發(fā)各種基于噬菌體的克隆載體。噬菌體的克隆載體。最先產(chǎn)生的兩類載體最先產(chǎn)生的兩類載體: : 插入載體插入載體(insertion) 置換載體置換載體( (替換載體替換載體) ) (replacement)插入載體插入載體插入載體的構(gòu)建過(guò)

42、程：插入載體的構(gòu)建過(guò)程： 去掉一大段非必需片段，剩下的兩段再連去掉一大段非必需片段，剩下的兩段再連接起來(lái)。接起來(lái)。 為了順利地插入新的為了順利地插入新的DNADNA，一個(gè)插入載體必，一個(gè)插入載體必須至少包含一個(gè)單酶切位點(diǎn)。須至少包含一個(gè)單酶切位點(diǎn)。 插入的插入的DNADNA片段的長(zhǎng)度依賴于刪除掉的非必片段的長(zhǎng)度依賴于刪除掉的非必需片段的長(zhǎng)度。需片段的長(zhǎng)度。兩個(gè)常用的插入載體：兩個(gè)常用的插入載體：(1)(1)gtl0gtl0 可以插入超過(guò)可以插入超過(guò)8kb8kb的外源的外源DNADNA。外源。外源DNADNA通通過(guò)過(guò)EcoEcoRIRI單酶切位點(diǎn)插入單酶切位點(diǎn)插入c cI I基因，并使該基基因，

43、并使該基因失活，使得重組體的噬菌斑是清澈的而不因失活，使得重組體的噬菌斑是清澈的而不是混濁的。是混濁的。 (2)(2)ZAPZAP 可以插入超過(guò)可以插入超過(guò)10kb10kb的外源的外源DNADNA。攜帶的。攜帶的lacZlacZ基因上有一個(gè)多接頭，外源基因插入基因上有一個(gè)多接頭，外源基因插入到這個(gè)多接頭上到這個(gè)多接頭上6 6個(gè)酶切位點(diǎn)中的任何一個(gè)，個(gè)酶切位點(diǎn)中的任何一個(gè)，都會(huì)使該基因失活，從而使重組體的噬菌斑都會(huì)使該基因失活，從而使重組體的噬菌斑是無(wú)色清澈的而不是藍(lán)色的。是無(wú)色清澈的而不是藍(lán)色的。置換載體置換載體一個(gè)一個(gè)置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識(shí)置換載體有克隆所需限制性內(nèi)切酶識(shí)別的兩個(gè)位

44、點(diǎn)，而在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的別的兩個(gè)位點(diǎn)，而在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNADNA片段將會(huì)被外源的片段將會(huì)被外源的DNADNA所置換。所置換。通常被置換的那段通常被置換的那段DNADNA（克隆術(shù)語(yǔ)中稱為填充（克隆術(shù)語(yǔ)中稱為填充片段）含有其他的一些限制性酶切位點(diǎn)，可片段）含有其他的一些限制性酶切位點(diǎn)，可被切成許多小片段，因此在克隆實(shí)驗(yàn)中它重被切成許多小片段，因此在克隆實(shí)驗(yàn)中它重新被插入的可能性相當(dāng)小。新被插入的可能性相當(dāng)小。置換載體可攜帶的置換載體可攜帶的DNADNA片段長(zhǎng)度通常超過(guò)插入片段長(zhǎng)度通常超過(guò)插入載體。載體。重組體的篩選往往基于它的大?。簺](méi)有重組重組體的篩選往往基于它的大?。簺](méi)有重組的載體因?yàn)樘?/p>

45、而不能被包裝進(jìn)入的載體因?yàn)樘《荒鼙话b進(jìn)入噬菌體噬菌體的頭部。的頭部。兩個(gè)常用的置換載體：(1)(1)EMBL4EMBL4 可以攜帶超過(guò)可以攜帶超過(guò)20kb20kb的外源的外源DNADNA。 在填充片段的兩邊有成對(duì)的在填充片段的兩邊有成對(duì)的EcoEcoRIRI，BamBamHIHI和和SalSalI I的酶切位點(diǎn)。的酶切位點(diǎn)。 用這用這3 3種酶中的任意一種進(jìn)行酶切都可以除種酶中的任意一種進(jìn)行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的的DNADNA。 重組體的篩選可以基于它的大小，也可以重組體的篩選可以基于它的大小，也可以應(yīng)用應(yīng)用SpiSpi

46、表型。表型。(2)(2)GEM11GEM11和和GEMl2GEMl2 都可以攜帶都可以攜帶23kb23kb的外源的外源DNADNA（接近理論上（接近理論上的最大值）。的最大值）。 在填充片段的兩邊各有一個(gè)多接頭，含有在填充片段的兩邊各有一個(gè)多接頭，含有7 7個(gè)不同的限制性酶切位點(diǎn)。個(gè)不同的限制性酶切位點(diǎn)。 這兩個(gè)載體多接頭略有不同，但這兩個(gè)載體多接頭略有不同，但最外面的最外面的一個(gè)都是一個(gè)都是SfiSfiI I酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(GGCCNNNNNGGCC)(GGCCNNNNNGGCC)。這個(gè)序列極其罕見(jiàn)，不太可能出現(xiàn)在被克隆這個(gè)序列極其罕見(jiàn)，不太可能出現(xiàn)在被克隆的的DNADNA片段中。片段中。

47、 因此可以用因此可以用SfiSfiI I把克隆后的把克隆后的DNADNA片段完整片段完整地切下來(lái)。地切下來(lái)。 和和EMBL4EMBL4相似，可以根據(jù)大小和相似，可以根據(jù)大小和SpiSpi表型表型篩選重組體。篩選重組體。3.3.4 3.3.4 用用插入載體或置換載體插入載體或置換載體進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)行克隆實(shí)驗(yàn)用用噬菌體載體進(jìn)行克隆和用質(zhì)粒載體相似：噬菌體載體進(jìn)行克隆和用質(zhì)粒載體相似： 限制性酶酶切載體，加入新的限制性酶酶切載體，加入新的DNADNA，連接混，連接混合物，產(chǎn)物分子轉(zhuǎn)染大腸桿菌。合物，產(chǎn)物分子轉(zhuǎn)染大腸桿菌。 這種實(shí)驗(yàn)需要把載體通過(guò)這種實(shí)驗(yàn)需要把載體通過(guò)coscos位點(diǎn)由氫鍵連位點(diǎn)由氫鍵

48、連接，以環(huán)狀分子形式存在。接，以環(huán)狀分子形式存在。這種轉(zhuǎn)染的方法在大多數(shù)情況下令人滿意，這種轉(zhuǎn)染的方法在大多數(shù)情況下令人滿意，但效率不高。但效率不高。如果增加一兩步操作，可以獲得更多的重組如果增加一兩步操作，可以獲得更多的重組體體。首先，要使用首先，要使用噬菌體載體的線狀分子。噬菌體載體的線狀分子。 當(dāng)線狀分子被相應(yīng)的酶酶切后，便形成了當(dāng)線狀分子被相應(yīng)的酶酶切后，便形成了左右兩個(gè)相互分離的片段。左右兩個(gè)相互分離的片段。 連接被克隆的連接被克隆的DNADNA和載體的左右兩個(gè)片段，和載體的左右兩個(gè)片段，連接的結(jié)果可能有好幾種不同的排列，其中連接的結(jié)果可能有好幾種不同的排列，其中包含一些由重復(fù)序列組

49、成的連環(huán)體，重復(fù)的包含一些由重復(fù)序列組成的連環(huán)體，重復(fù)的單位是：?jiǎn)挝皇牵狠d體的左片段載體的左片段被克隆的被克隆的DNADNA載體的右片段。載體的右片段。 如果被插入的如果被插入的DNADNA是正確的大小，那么分隔是正確的大小，那么分隔這些重復(fù)序列的這些重復(fù)序列的coscos相隔正確的距離，能夠相隔正確的距離，能夠用于體外包裝。產(chǎn)生重組后的噬菌體可以感用于體外包裝。產(chǎn)生重組后的噬菌體可以感染大腸桿菌。用這種方法，經(jīng)過(guò)體外包裝，染大腸桿菌。用這種方法，經(jīng)過(guò)體外包裝，可以獲得大量的重組分子?？梢垣@得大量的重組分子。3.3.5 3.3.5 用黏端質(zhì)粒對(duì)大的用黏端質(zhì)粒對(duì)大的DNADNA片段進(jìn)行克隆片段進(jìn)

50、行克隆基于基于噬菌體的克隆載體中，最復(fù)雜的形式噬菌體的克隆載體中，最復(fù)雜的形式是黏端質(zhì)粒。是黏端質(zhì)粒。黏端質(zhì)粒是噬菌體黏端質(zhì)粒是噬菌體DNADNA和大腸桿菌質(zhì)粒兩者的和大腸桿菌質(zhì)粒兩者的雜交體。雜交體。設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)：設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)： 把噬菌體把噬菌體DNADNA裝進(jìn)噬菌體頭部的酶，僅僅只裝進(jìn)噬菌體頭部的酶，僅僅只需要被包裝的分子擁有需要被包裝的分子擁有coscos位點(diǎn)就能夠發(fā)揮位點(diǎn)就能夠發(fā)揮作用。作用。 在體外包裝系統(tǒng)中除了在體外包裝系統(tǒng)中除了基因組外，任何基因組外，任何長(zhǎng)度在長(zhǎng)度在37kb37kb和和52kb52kb之間的之間的DNADNA分子，只要兩分子，只要兩端含有端含有coscos位點(diǎn)，就能

51、被包裝進(jìn)噬菌體頭部。位點(diǎn)，就能被包裝進(jìn)噬菌體頭部。黏端質(zhì)?；旧纤闶且粋€(gè)攜帶cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。因?yàn)樗鄙偎械囊驗(yàn)樗鄙偎械氖删w基因且不能產(chǎn)生噬菌體基因且不能產(chǎn)生噬菌斑，因此它需要有其他的篩選標(biāo)記，如噬菌斑，因此它需要有其他的篩選標(biāo)記，如氨芐青霉素耐藥性基因，也要有質(zhì)粒復(fù)制起氨芐青霉素耐藥性基因，也要有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。點(diǎn)。采用黏端質(zhì)粒的克隆實(shí)驗(yàn)步驟如下采用黏端質(zhì)粒的克隆實(shí)驗(yàn)步驟如下: : 從單酶切位點(diǎn)切開(kāi)黏端質(zhì)粒從單酶切位點(diǎn)切開(kāi)黏端質(zhì)粒; ; 加入新的加入新的DNADNA片段片段( (這些片段通常是不完這些片段通常是不完全酶切的產(chǎn)物，完全酶切后產(chǎn)生的片段對(duì)于全酶切的產(chǎn)物，完全酶切后產(chǎn)生的片段

52、對(duì)于黏端質(zhì)粒來(lái)說(shuō)太小了黏端質(zhì)粒來(lái)說(shuō)太小了);); 進(jìn)行連接反應(yīng)，形成連環(huán)體。進(jìn)行連接反應(yīng)，形成連環(huán)體。 如果插入的如果插入的DNADNA大小合適，體外包裝系統(tǒng)從大小合適，體外包裝系統(tǒng)從coscos位點(diǎn)切開(kāi)連環(huán)體，把重組后的黏端質(zhì)粒位點(diǎn)切開(kāi)連環(huán)體，把重組后的黏端質(zhì)粒包裝進(jìn)成熟的噬菌體顆粒。包裝進(jìn)成熟的噬菌體顆粒。用這些用這些噬菌體去感染大腸桿菌，但不會(huì)產(chǎn)噬菌體去感染大腸桿菌，但不會(huì)產(chǎn)生噬菌斑，把感染后的大腸桿菌培養(yǎng)在選擇生噬菌斑，把感染后的大腸桿菌培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基平板上，只有那些有抗生素抗性的性培養(yǎng)基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生長(zhǎng)。菌落才能生長(zhǎng)。所有的菌落都是重組體，因?yàn)槟切](méi)有重

53、組所有的菌落都是重組體，因?yàn)槟切](méi)有重組的線性的黏端質(zhì)粒太小，根本不可能被包裝的線性的黏端質(zhì)粒太小，根本不可能被包裝進(jìn)噬菌體頭部。進(jìn)噬菌體頭部。3.4 3.4 載體和其他高容量的載體載體和其他高容量的載體使基因組文庫(kù)得以建立使基因組文庫(kù)得以建立基于基于噬菌體的載體的主要用途是克隆那些噬菌體的載體的主要用途是克隆那些不能被質(zhì)?；虿荒鼙毁|(zhì)?；騇13M13載體所操作的載體所操作的DNADNA大片段。大片段。插入的外源插入的外源DNADNA片段：片段： M13M13載體：不超過(guò)載體：不超過(guò)3kb3kb 質(zhì)粒：不超過(guò)質(zhì)粒：不超過(guò)8kb8kb 置換載體置換載體EMBL4EMBL4：達(dá)到：達(dá)到20kb20k

54、b 某些黏端質(zhì)粒：某些黏端質(zhì)粒：40kb40kb。這種可以克隆如此之大的這種可以克隆如此之大的DNADNA片段的能力，使片段的能力，使得人們可以建立基因組文庫(kù)。得人們可以建立基因組文庫(kù)?；蚪M文庫(kù)：基因組文庫(kù)：一套覆蓋某個(gè)生物體所有一套覆蓋某個(gè)生物體所有DNADNA的重組體克隆。的重組體克隆。例如，一個(gè)大腸桿菌的基因組文庫(kù)，包含所例如，一個(gè)大腸桿菌的基因組文庫(kù)，包含所有的大腸桿菌基因。有的大腸桿菌基因。據(jù)此，可以抽提出任何我們所感興趣的基因據(jù)此，可以抽提出任何我們所感興趣的基因加以研究?；蚪M文庫(kù)可以保存很多年，也加以研究?；蚪M文庫(kù)可以保存很多年，也可以很容易在研究組織間相互傳播?？梢院苋菀?/p>

55、在研究組織間相互傳播。當(dāng)要建立基因組文庫(kù)時(shí)，面臨一個(gè)重要的問(wèn)題：一個(gè)基因組文庫(kù)到底需要多當(dāng)要建立基因組文庫(kù)時(shí)，面臨一個(gè)重要的問(wèn)題：一個(gè)基因組文庫(kù)到底需要多少個(gè)克隆少個(gè)克隆? ?可以用下面的公式計(jì)算：可以用下面的公式計(jì)算：N=ln(1-N=ln(1-P P) )ln(1-aln(1-ab)b)N N指所需要的克隆的個(gè)數(shù)，指所需要的克隆的個(gè)數(shù)，P P是得到所有基因的可能性，是得到所有基因的可能性，a a是插入到載體中去是插入到載體中去的的DNADNA片段的平均大小，片段的平均大小，b b是基因組的大小。是基因組的大小。從幾十萬(wàn)個(gè)克隆中一個(gè)個(gè)篩選出感興趣的基從幾十萬(wàn)個(gè)克隆中一個(gè)個(gè)篩選出感興趣的基因是

56、不明智的。因是不明智的。減少克隆數(shù)的方法：減少克隆數(shù)的方法：方法一：開(kāi)發(fā)能夠攜帶更大方法一：開(kāi)發(fā)能夠攜帶更大DNADNA片段的克隆載片段的克隆載體。體。細(xì)菌人工染色體（細(xì)菌人工染色體（BACsBACs）：）： 基于基于F F質(zhì)粒構(gòu)建的新載體。質(zhì)粒構(gòu)建的新載體。 F F質(zhì)粒相對(duì)較大，由它開(kāi)發(fā)的載體有著比普質(zhì)粒相對(duì)較大，由它開(kāi)發(fā)的載體有著比普通質(zhì)粒載體大很多的容量。通質(zhì)粒載體大很多的容量。 BACBAC能夠插入能夠插入超過(guò)超過(guò)300kb300kb的的DNADNA片段，由此片段，由此使人類基因組文庫(kù)的克隆數(shù)下降到使人類基因組文庫(kù)的克隆數(shù)下降到30 00030 000個(gè)。個(gè)。基于噬菌體基于噬菌體P1P

57、1發(fā)展而來(lái)的載體發(fā)展而來(lái)的載體 P1P1優(yōu)于優(yōu)于的地方：能夠在它的蛋白質(zhì)外殼的地方：能夠在它的蛋白質(zhì)外殼中擠進(jìn)中擠進(jìn)110kb110kb的的DNADNA?；谑删w基于噬菌體P1P1設(shè)計(jì)的黏端質(zhì)粒可以用于克隆設(shè)計(jì)的黏端質(zhì)?？梢杂糜诳寺￠L(zhǎng)度從長(zhǎng)度從75 kb75 kb到到100kb100kb的的DNADNA。還有一種載體，結(jié)合了還有一種載體，結(jié)合了P1P1載體和載體和BACBAC的特點(diǎn)，的特點(diǎn)，稱為稱為由由P1P1衍生的人工染色體衍生的人工染色體(P1-derived (P1-derived artificial chromosomeartificial chromosome，PAC)PAC)，

58、同樣也，同樣也擁有超過(guò)擁有超過(guò)300kb300kb的容量。的容量。3.5 3.5 其他細(xì)菌的克隆載體其他細(xì)菌的克隆載體人們還開(kāi)發(fā)了為其他一些細(xì)菌服務(wù)的載體。人們還開(kāi)發(fā)了為其他一些細(xì)菌服務(wù)的載體。這些載體中，這些載體中， 有的只對(duì)特定宿主有效的質(zhì)粒載體；有的只對(duì)特定宿主有效的質(zhì)粒載體； 有的是能夠在許多宿主中復(fù)制的廣譜宿主有的是能夠在許多宿主中復(fù)制的廣譜宿主質(zhì)粒；質(zhì)粒； 還有少數(shù)幾個(gè)是從噬菌體開(kāi)發(fā)出來(lái)的克隆還有少數(shù)幾個(gè)是從噬菌體開(kāi)發(fā)出來(lái)的克隆載體。載體。大多數(shù)這些載體的性質(zhì)和用法都和大腸桿菌大多數(shù)這些載體的性質(zhì)和用法都和大腸桿菌的載體很相似。的載體很相似。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于pBR322

59、pBR322有相當(dāng)高的拷貝數(shù)有相當(dāng)高的拷貝數(shù) 通常在被轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌中有大約通常在被轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌中有大約1515個(gè)個(gè)pBR322pBR322質(zhì)粒分子；質(zhì)粒分子； 在蛋白質(zhì)合成抑制劑在蛋白質(zhì)合成抑制劑( (如氯霉素如氯霉素) )的存在的存在下，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增，拷貝數(shù)可以增加到下，通過(guò)質(zhì)粒擴(kuò)增，拷貝數(shù)可以增加到1 1 000-3 000000-3 000。 這樣，通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大這樣，通過(guò)培養(yǎng)大腸桿菌就可以獲得大量重組過(guò)的量重組過(guò)的pBR322pBR322質(zhì)粒分子。質(zhì)粒分子。pGEM3ZpGEM3Z克隆克隆DNADNA的體外轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3ZpGEM3Z與與pUCpUC載體很相似：都含有載體很相似：都含有ampampR R和和lacZlacZ基因，在后者上有一個(gè)限制性酶切位基因，在后者上有一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，而