PCR實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析實(shí)用教案

1、第1頁/共43頁第一頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡史DNA的復(fù)制核酸(h sun)體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長第2頁/共43頁第二頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡史DNA的復(fù)制(fzh)核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物

2、第3頁/共43頁第三頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡史DNA的復(fù)制核酸(h sun)體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶第4頁/共43頁第四頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想(shxing)聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DN

3、A聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。 但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了第5頁/共43頁第五頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡史DNA的復(fù)制(fzh)核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化

4、熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎第6頁/共43頁第六頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介-定義 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，亦稱為無細(xì)胞分子克隆技術(shù)。它是以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，在一對人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速特異地擴(kuò)增出特定的DNA片斷。 簡單的講， PCR技術(shù)即通過引物延伸(ynshn)核酸的某個區(qū)域而進(jìn)行的重復(fù)雙向DNA合成。第7頁/共43頁第七頁，共44頁。第8頁/共43頁第八頁，共44頁。第9頁/共4

5、3頁第九頁，共44頁。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開始延伸，其5端是固定的，3端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成(hchng)的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時，由于新鏈模板的5端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、

6、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。 第10頁/共43頁第十頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介PCR反應(yīng)所用酶： 早期的PCR方法采用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片斷催化退火的寡核苷酸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)。由于該酶會在進(jìn)行DNA變性的溫度下失活，所以在每一輪合成反應(yīng)中都須重新加1份酶。并且在擴(kuò)增較長模板是效果不夠理想，產(chǎn)率較低，有一些錯配，導(dǎo)致產(chǎn)物大小不均一。 耐熱(nai r)DNA聚合酶是從一種嗜熱細(xì)菌嗜熱水生菌種提純出來

7、的，經(jīng)95持續(xù)溫育仍有活性，不會在加熱變性中失活，故無需每輪反應(yīng)都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和變性可以在更高溫度下進(jìn)行，使引物和模板間的誤配大大減少，提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率，并且可以擴(kuò)增更長的產(chǎn)物。第11頁/共43頁第十一頁，共44頁。()()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20第12頁/共43頁第十二頁，共44頁。第13頁/共43頁第十三頁，共44頁。1234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)(fnyng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)(chngf)13步2530輪目的(md)DN

8、A片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第14頁/共43頁第十四頁，共44頁。第15頁/共43頁第十五頁，共44頁。 PCR中后期，隨著目的DNA擴(kuò)展產(chǎn)物逐漸(zhjin)積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增加減慢，進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即為停滯效應(yīng)，又稱平臺期。第16頁/共43頁第十六頁，共44頁。操作方法 1 在PCR反應(yīng)管中加入( jir)buffer 2 向PCR加入( jir)dntpul 3 加入( jir)primer ul 4 加入( jir)模板 5 加酶 6 加水，至總體積為25微升？按緊蓋子， 輕輕混勻， 放入

9、PCR儀 如何加樣才能加得準(zhǔn)？第17頁/共43頁第十七頁，共44頁。5 反應(yīng)(fnyng)條件 942-5分鐘 94 40sec 57 40sec 72 1min 30sec 72 10min30-35cycle第18頁/共43頁第十八頁，共44頁。電泳(din yn)緩沖液的配制 50TAE Buffer 配制方法(fngf)： 1 稱量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L燒杯中； 2 向燒杯中加入約800ml去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆颍?3 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至1L后，室溫保存。 使用時稀釋50倍 即1

10、TAE Buffer 1.5%第19頁/共43頁第十九頁，共44頁。電泳(din yn) 按照5份PCR產(chǎn)物與一份(y fn)6loadingbuffer混合，取10-15ul混合液加入膠中，其中一孔加一份(y fn)Marker對照，電泳，電壓120，電泳半個小時，放入EB染色液中，染色半個小時，。第20頁/共43頁第二十頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介PCR常見問題：一.出現(xiàn)假陰性；二.出現(xiàn)假陽性(yngxng)；三.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶；四.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。第21頁/共43頁第二十一頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介一.PCR出現(xiàn)假陰性原因： 1模板因素： 2酶失活： 3引

11、物： 4Mg2+濃度： 5反應(yīng)體積的改變(gibin)： 6物理原因： 7靶序列變異：第22頁/共43頁第二十二頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性(ynxng)原因分析及解決方案模板因素：（1）模板中含有雜蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制劑；（3）模板中蛋白質(zhì)殘留(cnli)， 特別是染色體中的組蛋 白殘留(cnli)；（4）提取制備模板時丟失過多；（5）模板核酸變性不徹底。第23頁/共43頁第二十三頁，共44頁。PCR出現(xiàn)(chxin)假陰性原因分析及解決方案模板因素引起假陰性解決方案：1.配制有效而穩(wěn)定的消化處理液;2.提取(tq)程序固定,不宜隨意改動；3.模板DNA的溶解液應(yīng)固定不變。第

12、24頁/共43頁第二十四頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案酶失活：1.酶本身的質(zhì)量問題(供應(yīng)商的問題）；2.酶存放時間太長；3.酶存放方式不當(dāng)，或其他意外原因(yunyn)；4.忘記添加Taq酶。第25頁/共43頁第二十五頁，共44頁。PCR出現(xiàn)(chxin)假陰性原因分析及解決方案酶失活引起假陰性解決方案：1.檢查加樣程序及過程(guchng)，看是否忘記加Taq酶；2.更換新的Taq酶;3.新舊兩種Taq酶同時使用。第26頁/共43頁第二十六頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案引物：1.引物質(zhì)量；2.引物濃度(nngd)；3.兩條引物的

13、濃度(nngd)是否對稱等。 第27頁/共43頁第二十七頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案引物引起假陰性解決方案:1.選定一個好的引物合成單位;2.引物濃度不僅要看OD值，稀釋時更要平衡其摩爾濃度；3.引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止反復(fù)凍融或長期冷凍保存，導(dǎo)致引物的變質(zhì)降解失效，也可要求合成單位將固體分裝；4.引物設(shè)計(shj)不合理，如長度不夠，引物本身或兩條引物之間形成二聚體等。第28頁/共43頁第二十八頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案 Mg2+濃度： Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增效率影響極大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性；濃度過低

14、則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗(shbi)，出現(xiàn)假陰性。第29頁/共43頁第二十九頁，共44頁。PCR出現(xiàn)(chxin)假陰性原因分析及解決方案Mg2+濃度引起假陰性解決方案： 設(shè)置一組反應(yīng)，其中每一反應(yīng)中的其他(qt)離子濃度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2濃度不同（由0.56mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此來摸索最佳Mg2+濃度。第30頁/共43頁第三十頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性(ynxng)原因分析及解決方案反應(yīng)體積的改變： 做小體積PCR后，再做大體積時，一定要重新摸索條件，而非簡單地將反應(yīng)體系(tx)中的各個成分加大幾倍，否則易失敗。第3

15、1頁/共43頁第三十一頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案 物理原因： 1.變性溫度低，變性時間短； 2.退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率(xio l)； 3.延伸時間過短等。第32頁/共43頁第三十二頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性原因(yunyn)分析及解決方案物理原因引起假陰性解決方案：1.提高變性(binxng)溫度，延長變性(binxng)時間，特別是首次循環(huán)，必要時可設(shè)為95 ，10min，或PCR反應(yīng)以前在開水中煮沸幾分鐘。2.退火溫度應(yīng)根據(jù)Tm值來設(shè)定，也可首先將退火溫度設(shè)為45 ，然后再逐次提高（以2 /次為宜）。3.延伸溫度以1

16、000bp/min足夠，必要時也可適當(dāng)延長，特別是末次循環(huán)，一定要延伸10min。第33頁/共43頁第三十三頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陰性(ynxng)原因分析及解決方案 靶序列變異(biny)： 靶序列變異(biny)導(dǎo)致假引性的情況常常發(fā)生在靶序列變異(biny)正好發(fā)生于特異性引物與之結(jié)合部的中間，使引物失效。解決方案： 根據(jù)已知序列重新選擇區(qū)段設(shè)計引物。第34頁/共43頁第三十四頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介二.PCR出現(xiàn)假陽性原因：1.引物設(shè)計不合適；2.靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。（1）整個基因組或大片段的污染；（2）空氣中的小片斷(pindun)核酸污染。 第35頁/共4

17、3頁第三十五頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陽性原因(yunyn)分析及解決方案引物設(shè)計(shj)不合適： 1.選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，從而擴(kuò)增出非目的性序列的PCR產(chǎn)物。2.靶序列太短或引物太短導(dǎo)致特異性不強(qiáng)。解決方案： 選擇特異性強(qiáng)的區(qū)段設(shè)計(shj)引物。第36頁/共43頁第三十六頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陽性(yngxng)原因分析及解決方案整個基因組或大片段的污染的解決方案：1.操作時小心輕柔，防止(fngzh)將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管污染環(huán)境。2.除酶及不耐熱物品外，所有試劑及耗材均應(yīng)高溫高壓消毒，所用離心管及槍頭均應(yīng)一次性使用。3.必要時，加樣本前，反應(yīng)管及試劑

18、用紫外線照射，以破壞存在的核酸。第37頁/共43頁第三十七頁，共44頁。PCR出現(xiàn)假陽性(yngxng)原因分析及解決方案空氣中的小片斷核酸污染： 這些小片斷比靶序列短，但有一定(ydng)同源性，可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，導(dǎo)致假陽性出現(xiàn)。解決方案： 運(yùn)用巢式PCR來減輕或消除。第38頁/共43頁第三十八頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介三.出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶原因：1.引物與靶序列不完全互補(bǔ)(h b)，或引物聚合形成二聚體；2.Mg2+濃度過高，退火溫度過低，PCR循環(huán)次數(shù)過多；3.酶的質(zhì)量不過關(guān)，或加Taq酶的量過多。第39頁/共43頁第三十九頁，共44頁。PCR技術(shù)(jsh)簡介PCR出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶解決方案：