基因工程蛋白質(zhì)類藥物

1、基因工程細(xì)胞因子類藥物1基因工程肽類激素藥物2重組溶血栓藥物3基因工程酶類藥物4基因工程蛋白質(zhì)類藥物重組可溶性受體和黏附分子5 細(xì)胞因子是指機(jī)體細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽類因子，它們具有調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能和免疫功能，因而有可能利用基因工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，用于治療腫瘤、感染、免疫低下、造血功能障礙等疾病。目前已研制成功或正在研制的基因工程細(xì)胞因子類藥物主要有促紅細(xì)胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CF)、干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、生長(zhǎng)因子（GF）和凝血因子（F）等。一、基因工程細(xì)胞因子類藥物基因重組人促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin,EPO

2、） EPO是最早發(fā)現(xiàn)并首先運(yùn)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子， 1985年成功表達(dá)了重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)。rhEPO成為當(dāng)前研究開發(fā)最成功的基因工程藥物。 EPO是一種主要由腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素, 是作用于紅系祖細(xì)胞的造血生長(zhǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元的許多功能也具有重要的調(diào)控作用。 在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移，出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌 。EPO的產(chǎn)生與機(jī)體供氧狀況有關(guān)，低氧可刺激EPO的產(chǎn)生。EPO的分子結(jié)構(gòu)和功能 天然存在的 EPO 分為兩種類型 , 型含 35 %的糖基 ,型含 26 %的糖基。兩種類型在生物學(xué)特性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相

3、同。 人類 EPO 含有 166 個(gè)氨基酸 ,相對(duì)分子質(zhì)量為34 400 , hEPO上有4個(gè)半胱氨酸(7,29,33,161),在7161，2933之間以二硫鍵相連, 這對(duì)維持hEPO的生物學(xué)活性有重要作用。糖基化對(duì)穩(wěn)定 EPO 的體內(nèi)活性具有重要作用 ,若缺乏糖鏈 ,則 EPO 在體內(nèi)迅速被水解而失活。促細(xì)胞生成素的生物學(xué)作用EPO 主要通過(guò)促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細(xì)胞的生成。 促進(jìn)系祖細(xì)胞的增殖、分化和成熟 調(diào)控神經(jīng)元部分功能 對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度也有明顯的調(diào)節(jié)作用人促紅細(xì)胞生成素基因重組 天然的 hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿足需要。

4、因此，在20世紀(jì)80年代就開始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出 hEPO基因, 并研制成功 rhEPO。1985年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)rhEPO作為治療腎性貧血的藥物。 研制rhEPO的主要環(huán)節(jié)包括: 獲得人促紅細(xì)胞生成素基因和建立重組人促紅細(xì)胞生成素的有效表達(dá)系統(tǒng)等。獲得EPO基因 構(gòu)建基因組噬菌體文庫(kù)克隆EPO基因血細(xì)胞中提取基因組DNABamH酶切回收酶切片段插入噬菌體EMBL3載體中構(gòu)建基因組噬菌體文庫(kù)PCR方法從基因組模板中擴(kuò)增EPO基因片段為探針篩選完整EPO基因的插入片段克隆 人工化學(xué)合成的方法獲得EPO基因：對(duì)部份氨基酸序列進(jìn)行修改 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增EPO基因：人胎肝中提取總m

5、RNA RT-PCR技術(shù)克隆hEPO基因重組人促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)系統(tǒng) 為了獲得分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性與天然 EPO相似的rhEPO，選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、非洲綠猴腎細(xì)胞COS7表達(dá)系統(tǒng)、幼倉(cāng)鼠腎（BHK）細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。目前國(guó)內(nèi)外首選CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)用來(lái)表達(dá)生產(chǎn)rhEPO。 CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ：CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能準(zhǔn)確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后重組蛋白的加工修飾，表達(dá)的糖基化蛋白在分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性方面與天然蛋白十分接近。 CHO細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，而表達(dá)的外源產(chǎn)物是胞外分泌的，這樣便于產(chǎn)物的下游分離純化；在CHO細(xì)胞內(nèi)重組基因能高效擴(kuò)增

6、和表達(dá)；CHO細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，且具有較高的耐受剪切和滲透壓能力，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、乳腺表達(dá)系統(tǒng) 促紅細(xì)胞生成素臨床應(yīng)用 腎功能衰竭所致的貧血：這種病只有靠連續(xù)輸血維持生命，但輸血又使病人面臨病毒感染和血過(guò)量的危險(xiǎn)。EPO右刺激紅細(xì)胞生成，免去慢性腎衰竭病人的輸血。 癌性貧血：腫瘤引起的貧血或接受化療、放療所引起的貧血。 結(jié)締組織病貧血：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡所致的貧血。 骨髓增生異常綜合征貧血：促進(jìn)骨髓造血狀況改善。重組人促紅細(xì)胞生成素治療的不良反應(yīng) rhEPO在治療各種因素所引起的貧血中療效是肯定的，并且長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)毒性、無(wú)器官功能障礙、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)或抗體形成。但是也存在一些

7、副作用，最常見(jiàn)的是血壓升高，有的疾病治療過(guò)程中還出現(xiàn)靜脈血栓形成、出現(xiàn)高鉀血癥、頭痛、水潴留等。 應(yīng)該特別強(qiáng)調(diào)，雖然使用促紅細(xì)胞生成素能提高紅細(xì)胞的含量，可增強(qiáng)人體的機(jī)能，但長(zhǎng)時(shí)間或大劑量使用會(huì)產(chǎn)生上述嚴(yán)重的副作用，千萬(wàn)不要將此藥作為興奮劑。國(guó)際奧委會(huì)早在20世紀(jì)80年代就已宣布運(yùn)動(dòng)員禁用EPO來(lái)提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。但是近年來(lái)仍有一些運(yùn)動(dòng)員濫用rhEPO，成為運(yùn)動(dòng)員中最為常用的興奮劑之一。 用途 醫(yī)療用途：增加紅血球的數(shù)目，用于貧血、組織斷離、早產(chǎn)兒，用在癌學(xué)和血液學(xué)方面。 體育用途(興奮劑)：增加訓(xùn)練耐力和訓(xùn)練負(fù)荷，屬于國(guó)際奧委會(huì)規(guī)定的違禁藥物。在2008年北京奧運(yùn)會(huì)中第一例的興奮劑 檢查呈陽(yáng)性的

8、西班牙自行車選手瑪麗亞莫里諾，就是被發(fā)現(xiàn)使用使用促紅細(xì)胞生成素(EPO)，國(guó)際奧委會(huì)于2008年8月11日宣布 是對(duì)紅細(xì)胞的生成有增強(qiáng)作用的體液性因子。為分子量6-7萬(wàn)的糖蛋白，糖的含量多，已證明血和尿中都有它的存在。未分化的干細(xì)胞分化成紅細(xì)胞系干細(xì)胞（erythropoietin responsive cell），促紅細(xì)胞生成素在此發(fā)揮作用，使之變?yōu)榍俺杉t細(xì)胞。對(duì)進(jìn)一步再成熟為成紅血細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，血紅蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促進(jìn)作用。一般在貧血和低氧狀態(tài)時(shí)，根據(jù)身體組織對(duì)氧的需要，促紅細(xì)胞生成素的供給量將增加，但在腎臟貧血時(shí)其含量則非常低。其生成器官和機(jī)制雖尚未清楚，可是作為某腎

9、臟因子（renal erythropoietic factor）與血漿的基質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生腎小球的說(shuō)法是有力的。此外，起著相當(dāng)于促紅細(xì)胞生成素作用的因子中，促進(jìn)白細(xì)胞生成的有colony stimulating factor，促進(jìn)血小板生成的為促血小板生成素，包括促紅細(xì)胞生成素在內(nèi)，統(tǒng)稱為造血促進(jìn)因子。 臨床意義 1腎性貧血患者EPO水平較低，在進(jìn)行治療過(guò)程中，往往通過(guò)注射EPO來(lái)提高體內(nèi)EPO水平進(jìn)行治療，從而幫助病人增加紅細(xì)胞數(shù)量，此時(shí)EPO水平有所上升。 2其他貧血如缺鐵性貧血、巨細(xì)胞性貧血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治療，此時(shí)濃度也會(huì)有所升高。 3再生障礙性貧血和骨髓造血功能不全

10、患者EPO水平升高。 市場(chǎng)前景 紅細(xì)胞生成素，超級(jí)“重磅炸彈”基因藥物 1985年科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室獲得重組人EPO（rhEPO），1989年安進(jìn)（Amgen）公司的第一個(gè)基因重組藥物Epogen獲得FDA的批準(zhǔn)，適應(yīng)癥為慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血等，其市場(chǎng)表現(xiàn)不俗，1999年銷售值達(dá)到17.6億美元，2000年19.6億美元，2002年22.6億美元，2003年24.4億美元，成為名副其實(shí)的“重磅炸彈”基因藥物。 安進(jìn)（Amgen）開發(fā)的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細(xì)胞生成素新產(chǎn)品Arnesp2001年得到FDA的批準(zhǔn)，Arnesp2002

11、年初正式上市。Arnesp是一種“高糖基化”促紅素產(chǎn)品，其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力大大優(yōu)于第一代EPO（促紅細(xì)胞生成素）產(chǎn)品。第一年上市即大獲全勝，贏得開們紅，Aranesp2002年全年銷售額為4.2億美元，2003年全年銷售額為15.4億美元。估計(jì)在今后3年內(nèi)，Arnesp將創(chuàng)造10億15億美元的市場(chǎng)銷售額并奪取現(xiàn)有EPO生產(chǎn)商的部分市場(chǎng)，其市場(chǎng)前景不可估量。 2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷售額達(dá)21.1億美元，2002年達(dá)26.8億美元，2003年全世界EPO的年銷售額超過(guò)50億美元。創(chuàng)下生物工程藥品單個(gè)品種之最，是當(dāng)今最成功的基因工程藥物。 強(qiáng)生（Johnson&J

12、ohnson）公司的促紅細(xì)胞生成素Procrit/Eprex更是表現(xiàn)不俗，2001年銷售額34.42億美元，2002年銷售額42.69億美元， 2003年銷售收入達(dá)到39.84億美元。 目前，國(guó)內(nèi)已有10多家單位獲準(zhǔn)生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素。沈陽(yáng)三生和上海麒麟鯤鵬（中國(guó)）生物藥業(yè)的產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)醫(yī)院的銷售額獨(dú)領(lǐng)風(fēng)騷，2001年EPO的國(guó)內(nèi)醫(yī)院銷售總額約為47449萬(wàn)元，2002年為49508萬(wàn)元，2003年上半年為28606萬(wàn)元。估計(jì)國(guó)內(nèi)的年市場(chǎng)容量在20到30億元左右，但目前年銷售額只有區(qū)區(qū)5億元左右。 長(zhǎng)效紅細(xì)胞生成素1EPO 融合蛋白2其他促紅細(xì)胞生成素3新型促紅細(xì)胞生成素長(zhǎng)效紅細(xì)胞生成素 新紅細(xì)胞

13、生成刺激蛋白(NESP)：是美國(guó) Amgen 公司研制的長(zhǎng)效 EPO 制劑 ,于 2001 年 6 月底獲得歐洲藥物評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn) ,用于慢性腎衰引起的貧血。NESP 是一種高糖基化 rhEPO 類似物,也是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床的新型促紅細(xì)胞生成素 ,具有 rhEPO 相似的作用機(jī)制即刺激紅系造血。 NESP 含 5 個(gè) N-糖基化位點(diǎn)及比 rhEPO 高 2 倍的唾液酸殘基 ,在一級(jí)結(jié)構(gòu)中多了 5 個(gè)氨基酸和 N 端另外 2 個(gè)糖基化位點(diǎn) ,從而達(dá)到較大的代謝穩(wěn)定性和3 倍于 rhEPO 的半衰期 (36 h , rhEPO 為 48 h) ,可減少給藥次數(shù)。其副作用與 EPO 相同。迄今為

14、止尚未檢測(cè)出 NESP抗體。NESP是一種安全、有效并有應(yīng)用前景的新的 EPO 制劑。EPO 融合蛋白 法國(guó)學(xué)者Dalle等 ,于2001 年利用基因重組技術(shù)合成了一種二聚體 EPO ,由兩個(gè) EPO 及一個(gè) 9 肽連接而成的融合蛋白。 實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論由化學(xué)交聯(lián)還是由重組 DNA 介導(dǎo)的編碼區(qū)融合而獲得的兩個(gè) EPO 分子的耦聯(lián) ,都能得到比天然單體更穩(wěn)定 ,體內(nèi)壽命更長(zhǎng)的蛋白。其他促紅細(xì)胞生成素 EPO 模擬肽是Wrighton等在 1996 年采用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)在肽庫(kù)中篩選出來(lái)的 20 肽 ,其相對(duì)分子質(zhì)量遠(yuǎn)小于EPO 的相對(duì)分子質(zhì)量 ,但其生物功能與 EPO 基本相同 ,能與 EPO

15、受體結(jié)合 ,激活后能引起一個(gè)與 EPO本身完全相同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)機(jī)制 ,是一個(gè)具有潛在應(yīng)用價(jià)值的小活性肽。 EPO 模擬肽同天然 EPO比活性仍很低 ,且相對(duì)分子質(zhì)量很小 ,直接用于表達(dá)有較大困難。 采用特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建串聯(lián)體 ,其優(yōu)點(diǎn)在于可人為地控制串聯(lián)體的大小。從理論上講只要不超出一定范圍 ,可構(gòu)建 4 串聯(lián)體、8 串聯(lián)體、16 串聯(lián)體等任意大小的模擬肽多聚體。謝謝大家促紅細(xì)胞生成素臨床應(yīng)用 腎功能衰竭所致的貧血：這種病只有靠連續(xù)輸血維持生命，但輸血又使病人面臨病毒感染和血過(guò)量的危險(xiǎn)。EPO右刺激紅細(xì)胞生成，免去慢性腎衰竭病人的輸血。 癌性貧血：腫瘤引起的貧血或接受化療、放療所引

16、起的貧血。 結(jié)締組織病貧血：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡所致的貧血。 骨髓增生異常綜合征貧血：促進(jìn)骨髓造血狀況改善。重組人促紅細(xì)胞生成素治療的不良反應(yīng) rhEPO在治療各種因素所引起的貧血中療效是肯定的，并且長(zhǎng)期應(yīng)用無(wú)毒性、無(wú)器官功能障礙、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)或抗體形成。但是也存在一些副作用，最常見(jiàn)的是血壓升高，有的疾病治療過(guò)程中還出現(xiàn)靜脈血栓形成、出現(xiàn)高鉀血癥、頭痛、水潴留等。 應(yīng)該特別強(qiáng)調(diào)，雖然使用促紅細(xì)胞生成素能提高紅細(xì)胞的含量，可增強(qiáng)人體的機(jī)能，但長(zhǎng)時(shí)間或大劑量使用會(huì)產(chǎn)生上述嚴(yán)重的副作用，千萬(wàn)不要將此藥作為興奮劑。國(guó)際奧委會(huì)早在20世紀(jì)80年代就已宣布運(yùn)動(dòng)員禁用EPO來(lái)提高運(yùn)動(dòng)成績(jī)。但是近年來(lái)仍有一些運(yùn)動(dòng)員濫用rhEPO，成為運(yùn)動(dòng)員中最為常用的興奮劑之一。 重組人促紅細(xì)胞生成素治療的不良反應(yīng)