內(nèi)毒素檢測(cè)進(jìn)展

1、1 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室室樊樊 新新內(nèi)毒素檢測(cè)進(jìn)展及臨床意義2 內(nèi)毒素（內(nèi)毒素（Endotoxin, ET）是革蘭氏陰）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，其化學(xué)成分為脂性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，其化學(xué)成分為脂多糖（多糖（Lipopolysaccharide，LPS），由類脂），由類脂A、核心寡聚糖、核心寡聚糖O及多糖側(cè)鏈組成。及多糖側(cè)鏈組成。3一、內(nèi)毒素的產(chǎn)生，作用機(jī)理及一、內(nèi)毒素的產(chǎn)生，作用機(jī)理及生物學(xué)效應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)u內(nèi)毒素的產(chǎn)生內(nèi)毒素的產(chǎn)生 以往認(rèn)為以往認(rèn)為ET作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分只有在菌體作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分只有在菌體死亡或人工裂解時(shí)才能釋放出來。

2、但近年來發(fā)現(xiàn)死亡或人工裂解時(shí)才能釋放出來。但近年來發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性桿菌在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺革蘭氏陰性桿菌在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)也可以以乏時(shí)也可以以“出皰疹出皰疹”的方式被釋放的方式被釋放ET。4 u ET的入血途徑的入血途徑 l腸道內(nèi)毒素的吸收腸道內(nèi)毒素的吸收l敗血癥時(shí)血中細(xì)菌的釋放敗血癥時(shí)血中細(xì)菌的釋放 l外源性輸入外源性輸入 5u內(nèi)毒素的作用機(jī)理內(nèi)毒素的作用機(jī)理LPSLPS-LBP（LPS結(jié)合蛋白）結(jié)合蛋白）LPS-SCO14（細(xì)胞膜上的受體）（細(xì)胞膜上的受體）信號(hào)傳遞信號(hào)傳遞信號(hào)傳遞信號(hào)傳遞CD14+細(xì)胞細(xì)胞（M，PMN，單核核細(xì)胞），單核核細(xì)胞）CD14細(xì)胞細(xì)胞（上皮細(xì)

3、胞等）（上皮細(xì)胞等）吞噬作用吞噬作用殺菌活性殺菌活性一級(jí)介質(zhì)釋放一級(jí)介質(zhì)釋放粘附分子表達(dá)粘附分子表達(dá)細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)6TNF、IL-1IL-6、IL-8瀑布樣反應(yīng)，全身炎性反應(yīng)綜合癥瀑布樣反應(yīng)，全身炎性反應(yīng)綜合癥急性炎癥急性炎癥PG、TXA、LTC、PAG、C5a、O2-、NO，彈力酶，彈力酶（二級(jí)介質(zhì)）（二級(jí)介質(zhì)）膿毒綜合征膿毒綜合征（發(fā)熱、低溫、心動(dòng)過速、尿少、酸中毒、低血壓）（發(fā)熱、低溫、心動(dòng)過速、尿少、酸中毒、低血壓）DIC內(nèi)毒素休克內(nèi)毒素休克MOSF（多器官功能衰竭）（多器官功能衰竭）死亡死亡7內(nèi)毒素的生物學(xué)效應(yīng)內(nèi)毒素的生物學(xué)效應(yīng)l發(fā)熱反應(yīng)發(fā)熱反應(yīng)l白細(xì)胞反應(yīng)白細(xì)胞反應(yīng)l內(nèi)毒素血癥（

4、內(nèi)毒素血癥（ETM）與內(nèi)毒素休克（）與內(nèi)毒素休克（ETS）l彌漫性血管內(nèi)凝血（彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC） 8二、內(nèi)毒素的檢測(cè)二、內(nèi)毒素的檢測(cè)目前內(nèi)毒素檢測(cè)的方法主要有：目前內(nèi)毒素檢測(cè)的方法主要有： 鱟試驗(yàn)鱟試驗(yàn) ELISA法法 結(jié)合免疫鱟試驗(yàn)法（結(jié)合免疫鱟試驗(yàn)法（IML） 自動(dòng)化動(dòng)力學(xué)方法自動(dòng)化動(dòng)力學(xué)方法 化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法 光纖維生物傳感法光纖維生物傳感法 毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法9鱟試驗(yàn)鱟試驗(yàn) 鱟試驗(yàn)（鱟試驗(yàn)（LT）檢測(cè)）檢測(cè)LPS機(jī)理是機(jī)理是LPS通過激活通過激活C、B因子、前凝固酶而使可凝蛋白變成凝固蛋白，形成因子、前凝固酶而使可凝蛋白變成凝固蛋白，形成肉眼可見的膠凍狀物，通過比濁，

5、對(duì)肉眼可見的膠凍狀物，通過比濁，對(duì)LPS進(jìn)行半定進(jìn)行半定量或定量檢測(cè)。該法簡(jiǎn)單、無需特殊設(shè)備、耗費(fèi)少、量或定量檢測(cè)。該法簡(jiǎn)單、無需特殊設(shè)備、耗費(fèi)少、敏感性較好，可檢測(cè)出敏感性較好，可檢測(cè)出0.011ng/ml的的LPS，但易受，但易受多種因素的影響。多種因素的影響。10 標(biāo)本顏色的深淺可使敏感性偏低；標(biāo)本顏色的深淺可使敏感性偏低；受血漿中受血漿中LPS抑制因子的干擾；抑制因子的干擾；非特異性凝血酶、凝血活非特異性凝血酶、凝血活酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鱟變形細(xì)胞溶酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶等均可使鱟變形細(xì)胞溶解物產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；解物產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；LT法的標(biāo)準(zhǔn)化問題（目前法的標(biāo)準(zhǔn)化問題（目

6、前國(guó)際尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)）。國(guó)際尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)）。11 ELISA法法 利用多粘菌素利用多粘菌素B L聚組氨酸及廣譜交叉反應(yīng)聚組氨酸及廣譜交叉反應(yīng)性的抗性的抗LPSMcAb與與LPS有廣泛的結(jié)合能力的特點(diǎn)，有廣泛的結(jié)合能力的特點(diǎn)，用其包被微量反應(yīng)板，加入待檢樣品，再加抗用其包被微量反應(yīng)板，加入待檢樣品，再加抗LPS單克隆抗體（單克隆抗體（McAb），通過酶標(biāo)二抗的顯示來定），通過酶標(biāo)二抗的顯示來定量測(cè)定量測(cè)定LPS，該法敏感性不高（，該法敏感性不高（0.5ng/ml），與），與LT法的相當(dāng)法的相當(dāng),但定量準(zhǔn)確性高于但定量準(zhǔn)確性高于LT法。法。12結(jié)合免疫鱟試驗(yàn)法（結(jié)合免疫鱟試驗(yàn)法（Immunolimu

7、lus, IML） 以廣泛交叉反應(yīng)性抗以廣泛交叉反應(yīng)性抗LPSMcAb（Wn1222-5）來捕獲來捕獲LPS，再與鱟試劑反應(yīng)再與鱟試劑反應(yīng)，可定量檢測(cè)樣本中可定量檢測(cè)樣本中腸桿菌科細(xì)菌感染所釋放的腸桿菌科細(xì)菌感染所釋放的LPS，敏感性可達(dá)，敏感性可達(dá)100pg/ml。該法以抗。該法以抗LPS單克隆抗體為探針使內(nèi)毒單克隆抗體為探針使內(nèi)毒素血癥檢測(cè)特異性得以改善，且不受標(biāo)本濁度、放素血癥檢測(cè)特異性得以改善，且不受標(biāo)本濁度、放置時(shí)間、抑制因子等非特異性因素的影響，但仍不置時(shí)間、抑制因子等非特異性因素的影響，但仍不能避免鱟試劑自身因素的影響。能避免鱟試劑自身因素的影響。13自動(dòng)化動(dòng)力學(xué)方法自動(dòng)化動(dòng)力學(xué)

8、方法 該方法先用該方法先用KOH的復(fù)合堿試劑在微量反應(yīng)板上對(duì)的復(fù)合堿試劑在微量反應(yīng)板上對(duì)血漿標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，以去除或滅活其中的干擾因血漿標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，以去除或滅活其中的干擾因子及酶抑制物，再直接加入對(duì)子及酶抑制物，再直接加入對(duì)LPS高度特異的產(chǎn)色高度特異的產(chǎn)色鱟試劑（鱟試劑（Endospecy），隨后啟動(dòng)動(dòng)態(tài)顯色測(cè)定程），隨后啟動(dòng)動(dòng)態(tài)顯色測(cè)定程序，檢測(cè)儀自動(dòng)繪制序，檢測(cè)儀自動(dòng)繪制30min內(nèi)的各孔反應(yīng)曲線，根內(nèi)的各孔反應(yīng)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中的據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中的LPS濃度。濃度。 14 該方法對(duì)該方法對(duì)LPS的定量范圍為的定量范圍為10100pg/ml。反應(yīng)中。反應(yīng)中所用產(chǎn)色鱟

9、試劑不含所用產(chǎn)色鱟試劑不含G因子，因此可避免與標(biāo)本中因子，因此可避免與標(biāo)本中存在的真菌發(fā)生凝固作用而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，其存在的真菌發(fā)生凝固作用而出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，其優(yōu)點(diǎn)還體現(xiàn)在標(biāo)本先用堿處理，從而克服了鱟試劑優(yōu)點(diǎn)還體現(xiàn)在標(biāo)本先用堿處理，從而克服了鱟試劑內(nèi)的一些影響因素。內(nèi)的一些影響因素。15化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法 利用利用CR1和和CR3受體誘導(dǎo)中性多核粒細(xì)胞中的氧受體誘導(dǎo)中性多核粒細(xì)胞中的氧化產(chǎn)物作為檢測(cè)平臺(tái)，依靠化產(chǎn)物作為檢測(cè)平臺(tái)，依靠LPSLPS抗體復(fù)合物抗體復(fù)合物使全血中的中性粒細(xì)胞所釋放的氧化物質(zhì)，引起補(bǔ)使全血中的中性粒細(xì)胞所釋放的氧化物質(zhì)，引起補(bǔ)體調(diào)理酵母多糖，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)（體調(diào)理酵

10、母多糖，導(dǎo)致發(fā)光物質(zhì)（CL）氧化而發(fā)光，）氧化而發(fā)光，通過儀器光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光的強(qiáng)度而定量測(cè)定血中通過儀器光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光的強(qiáng)度而定量測(cè)定血中的內(nèi)毒素，對(duì)的內(nèi)毒素，對(duì)LPS定量范圍為定量范圍為20200pg/ml。該法對(duì)。該法對(duì)大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌的大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌的LPS有廣泛的反應(yīng)性，而有廣泛的反應(yīng)性，而對(duì)革蘭氏陽性菌、曲霉菌等無反應(yīng)，可望成為臨床對(duì)革蘭氏陽性菌、曲霉菌等無反應(yīng)，可望成為臨床診斷內(nèi)毒素血癥的有用工具。診斷內(nèi)毒素血癥的有用工具。16光纖維生物傳感法光纖維生物傳感法 利用短波光纖維生物傳感器檢測(cè)利用短波光纖維生物傳感器檢測(cè)LPS，最低敏感，最低敏感性為性為10ng/ml，可

11、在，可在30s內(nèi)完成。其原理是共價(jià)結(jié)合內(nèi)完成。其原理是共價(jià)結(jié)合于光纖維探針表面上的多粘菌素于光纖維探針表面上的多粘菌素B可選擇性地結(jié)合可選擇性地結(jié)合熒光標(biāo)記的熒光標(biāo)記的LPS，未標(biāo)記的，未標(biāo)記的LPS在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中根據(jù)在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中根據(jù)已標(biāo)記的已標(biāo)記的LPS產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度得以定量檢測(cè)。此法產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度得以定量檢測(cè)。此法不僅應(yīng)用于臨床而且還可應(yīng)用于環(huán)境中不僅應(yīng)用于臨床而且還可應(yīng)用于環(huán)境中LPS的檢測(cè)，的檢測(cè)，該法雖快速簡(jiǎn)便，但敏感性不如該法雖快速簡(jiǎn)便，但敏感性不如IML法和法和ELISA法。法。17毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法 LPS是缺乏有旋光力的基團(tuán)，檢測(cè)其未衍化的狀是缺乏有旋光力的基團(tuán)，檢測(cè)其未

12、衍化的狀態(tài)比較困難。硼酸鹽可與態(tài)比較困難。硼酸鹽可與LPS分子的二乙基結(jié)合使分子的二乙基結(jié)合使其旋光力增強(qiáng)，采用其旋光力增強(qiáng)，采用UV活性多粘菌素活性多粘菌素B與與LPS形成形成復(fù)合物或熒光素異硫基氟酸鹽標(biāo)記復(fù)合物或熒光素異硫基氟酸鹽標(biāo)記LPS亦可達(dá)到目亦可達(dá)到目的。方法是將處理過的標(biāo)本吸入毛細(xì)管，用標(biāo)準(zhǔn)磷的。方法是將處理過的標(biāo)本吸入毛細(xì)管，用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖液（酸鹽緩沖液（100mg/ml）做電泳，）做電泳，6min內(nèi)即可完成內(nèi)即可完成檢測(cè)。此法敏感性為檢測(cè)。此法敏感性為35pg/ml，但電泳的條件不易，但電泳的條件不易掌握，且易受某些技術(shù)因素或固有誤差的影響，目掌握，且易受某些技術(shù)因素或固有

13、誤差的影響，目前尚難以推廣應(yīng)用。前尚難以推廣應(yīng)用。18MB80內(nèi)毒素測(cè)定系統(tǒng)內(nèi)毒素測(cè)定系統(tǒng)內(nèi)毒素葡聚糖 19l儀器概述儀器概述 MB80內(nèi)毒素定量測(cè)定系統(tǒng)是專門用于定量測(cè)內(nèi)毒素定量測(cè)定系統(tǒng)是專門用于定量測(cè)定藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械及食品定藥品、生物制品、血液制品、醫(yī)療器械及食品中的內(nèi)毒素含量，更重要的是在臨床上用來測(cè)定中的內(nèi)毒素含量，更重要的是在臨床上用來測(cè)定病人各種體液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量水平，以診斷病人各種體液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量水平，以診斷及鑒別診斷內(nèi)毒素血癥及感染的類型和程度，也及鑒別診斷內(nèi)毒素血癥及感染的類型和程度，也作為觀察內(nèi)毒素血癥療效的重要指標(biāo)。作為觀察內(nèi)毒素血癥療效的重

14、要指標(biāo)。20l檢測(cè)原理檢測(cè)原理 主要原理與鱟試驗(yàn)的反應(yīng)原理相同：利用革主要原理與鱟試驗(yàn)的反應(yīng)原理相同：利用革蘭氏陰性菌脂多糖激活酶反應(yīng)主劑蘭氏陰性菌脂多糖激活酶反應(yīng)主劑A中的相應(yīng)因中的相應(yīng)因子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對(duì)革子后形成凝固蛋白，根據(jù)其引起的濁度變化對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖濃度進(jìn)行定量測(cè)定。蘭氏陰性菌脂多糖濃度進(jìn)行定量測(cè)定。21三、內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床意義三、內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床意義正常參考值：正常參考值：正常人血漿內(nèi)毒素含量正常人血漿內(nèi)毒素含量80%），而且血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平與內(nèi)毒素血癥發(fā)），而且血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平與內(nèi)毒素血癥發(fā)生率及含量無明顯關(guān)系。生率及含量無明顯關(guān)系。24肝硬

15、化：肝硬化：肝臟可攝取血流中內(nèi)毒素的肝臟可攝取血流中內(nèi)毒素的8090%，由于，由于肝硬變后造成的肝枯否氏細(xì)胞清除能力下降及肝內(nèi)肝硬變后造成的肝枯否氏細(xì)胞清除能力下降及肝內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和血流的改變，肝內(nèi)毒素?cái)z取減少，造成組織結(jié)構(gòu)和血流的改變，肝內(nèi)毒素?cái)z取減少，造成嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥。嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥。膽道疾病膽道疾病：膽石癥伴膽囊炎的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率：膽石癥伴膽囊炎的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率為為78；化膿性膽管炎為；化膿性膽管炎為20；梗阻性黃疸的程度；梗阻性黃疸的程度與內(nèi)毒素濃度以及持續(xù)時(shí)間有一定關(guān)系，術(shù)后的內(nèi)與內(nèi)毒素濃度以及持續(xù)時(shí)間有一定關(guān)系，術(shù)后的內(nèi)毒素血癥發(fā)病率為毒素血癥發(fā)病率為5075%，是術(shù)后

16、出現(xiàn)并發(fā)癥，是術(shù)后出現(xiàn)并發(fā)癥和患者死亡的一個(gè)重要原因。和患者死亡的一個(gè)重要原因。25急性胰腺炎：急性胰腺炎：急性胰腺炎并發(fā)內(nèi)毒素血癥較常見，約占急性胰腺炎并發(fā)內(nèi)毒素血癥較常見，約占66，值得注意的是致死病例生前均并發(fā)內(nèi)毒素血癥且持續(xù)存，值得注意的是致死病例生前均并發(fā)內(nèi)毒素血癥且持續(xù)存在直至死亡。因此早期測(cè)定內(nèi)毒素水平有助于判斷疾病的嚴(yán)在直至死亡。因此早期測(cè)定內(nèi)毒素水平有助于判斷疾病的嚴(yán)重程度，指導(dǎo)治療，防止惡化。重程度，指導(dǎo)治療，防止惡化。潰瘍性結(jié)腸炎：潰瘍性結(jié)腸炎：此病的內(nèi)毒素血癥發(fā)病率高達(dá)此病的內(nèi)毒素血癥發(fā)病率高達(dá)100，也，也有個(gè)別報(bào)道的陽性率僅為有個(gè)別報(bào)道的陽性率僅為25。但多數(shù)認(rèn)為內(nèi)

17、毒素血癥是該。但多數(shù)認(rèn)為內(nèi)毒素血癥是該病的重要并發(fā)癥。病的重要并發(fā)癥。26細(xì)菌性感染的輔助診斷、治療和預(yù)后判斷細(xì)菌性感染的輔助診斷、治療和預(yù)后判斷l(xiāng)全身性細(xì)菌感染：全身性細(xì)菌感染：全身性細(xì)菌感染主要見于敗血全身性細(xì)菌感染主要見于敗血癥。革蘭氏陰性細(xì)菌性敗血癥常并發(fā)內(nèi)毒素血癥。癥。革蘭氏陰性細(xì)菌性敗血癥常并發(fā)內(nèi)毒素血癥。這種敗血癥較常見的致病菌為沙門氏菌屬、腦膜這種敗血癥較常見的致病菌為沙門氏菌屬、腦膜炎雙球菌屬及擬桿菌屬。這些致病菌多通過泌尿炎雙球菌屬及擬桿菌屬。這些致病菌多通過泌尿道、腸道、膽道及呼吸道而引起感染，也可通過道、腸道、膽道及呼吸道而引起感染，也可通過外傷、外科手術(shù)、導(dǎo)管檢查或留

18、置，以及器械操外傷、外科手術(shù)、導(dǎo)管檢查或留置，以及器械操作等途徑而進(jìn)入血液，并大量繁殖引起敗血癥，作等途徑而進(jìn)入血液，并大量繁殖引起敗血癥，從而造成內(nèi)毒素血癥。從而造成內(nèi)毒素血癥。27l局部性細(xì)菌感染：局部性細(xì)菌感染：局部性細(xì)菌感染造成內(nèi)毒素血局部性細(xì)菌感染造成內(nèi)毒素血癥的有肺炎、膽囊炎、燒傷合并感染、穿孔性腹癥的有肺炎、膽囊炎、燒傷合并感染、穿孔性腹膜炎、化膿性膽管炎、肝膿腫、腎盂炎、卵巢囊膜炎、化膿性膽管炎、肝膿腫、腎盂炎、卵巢囊腫扭轉(zhuǎn)伴尿路感染、腸結(jié)核及肺結(jié)核伴綠膿桿菌腫扭轉(zhuǎn)伴尿路感染、腸結(jié)核及肺結(jié)核伴綠膿桿菌感染、非特異性出血性小腸炎及腎周圍炎等。感染、非特異性出血性小腸炎及腎周圍炎等。l對(duì)尿液進(jìn)行內(nèi)毒素測(cè)定可成功地檢出革蘭氏陰性對(duì)尿液進(jìn)行內(nèi)毒素測(cè)定可成功地檢出革蘭氏陰性細(xì) 菌 菌 尿 癥