李芳-重組梅毒螺旋體抗原TpN17純化及基于金磁微粒梅毒螺旋體抗體的檢測(西北大學碩士學位答辯PPT)20075

1、重組梅毒螺旋體抗原重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化及基于的純化及基于金磁微粒梅毒螺旋體抗體的檢測金磁微粒梅毒螺旋體抗體的檢測答答 辯辯 人人: 李李 芳芳專專 業(yè)業(yè): 細胞生物學細胞生物學導導 師師: 崔亞麗崔亞麗 教授教授 1主要內容主要內容梅毒和金磁微粒概述梅毒和金磁微粒概述重組梅毒螺旋體抗原重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化和標記及其滴的純化和標記及其滴 度測定度測定應用金磁微粒檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立應用金磁微粒檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立 西北大學碩士研究生論文答辯2梅毒概述 西北大學碩士研究生論文答辯梅毒（梅毒（Syphilis） 是一種由梅毒螺旋體（是一種由梅毒螺旋體（Trep

2、onema pallidum, Tp）引起的性傳）引起的性傳 染病，染病，發(fā)病率逐年遞增發(fā)病率逐年遞增 。因此，梅毒已經(jīng)成為一個嚴重的公共。因此，梅毒已經(jīng)成為一個嚴重的公共 衛(wèi)生問題。衛(wèi)生問題。檢測方法檢測方法 梅毒概述3梅毒螺旋體檢測方法比較方法方法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點暗視野顯微鏡法暗視野顯微鏡法 快速、直接快速、直接 陽性率較低陽性率較低 免疫熒光染色法免疫熒光染色法 可區(qū)分梅毒螺旋體與其它可區(qū)分梅毒螺旋體與其它條件致病性螺旋體條件致病性螺旋體 可導致假陰性可導致假陰性 性病研究實驗室試驗性病研究實驗室試驗 操作簡便，成本低廉操作簡便，成本低廉 對一期梅毒敏感性不高對一期梅毒敏感性不高 快速血

3、漿反應素環(huán)狀卡片試驗快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 肉眼即可讀出結果肉眼即可讀出結果 對一期梅毒敏感性不高對一期梅毒敏感性不高梅毒螺旋體血球凝集試驗梅毒螺旋體血球凝集試驗 敏感性和特異性較好敏感性和特異性較好 易造成判斷差錯易造成判斷差錯 熒光密螺旋體抗體吸收試驗熒光密螺旋體抗體吸收試驗敏感性好敏感性好不能判斷治療情況不能判斷治療情況梅毒螺旋體明膠凝集試驗梅毒螺旋體明膠凝集試驗梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗 特異性高特異性高很高的靈敏度和特異性很高的靈敏度和特異性成本高，不能自動化成本高，不能自動化 西北大學碩士研究生論文答辯梅毒概述4 西北大學碩士研究生論文答辯 金磁微粒概

4、述金磁微粒概述定義 金磁微粒(Fe3O4/Au)是結合磁性氧化物粒子和膠體金特點的新型磁性復合微粒。 磁性粒子聚集體磁性粒子聚集體納米金粒子納米金粒子 5應用金磁微粒檢測梅毒螺旋體抗體示意圖HRP-TpAgTpAbTpAgGoldmag梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯6研究內容、意義 西北大學碩士研究生論文答辯研究內容及意義運用陽離子交換層析運用陽離子交換層析純化純化梅毒螺旋體抗原梅毒螺旋體抗原Tp17并對其進行并對其進行HRP標記標記，以雙抗原夾心法測定純化及標記抗原的，以雙抗原夾心法測定純化及標記抗原的滴度滴度以以金磁微粒金磁微粒為固相載體，建立檢測血液中為固相載體，建立檢測

5、血液中梅毒螺旋體抗體梅毒螺旋體抗體的的方法，為將金磁微粒應用于臨床檢驗提供實驗依據(jù)方法，為將金磁微粒應用于臨床檢驗提供實驗依據(jù)7實驗一:重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 應用應用CM介質介質對抗原進行純化研究對抗原進行純化研究純化抗原的純化抗原的標記標記及其滴度及其滴度測定測定重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 西北大學碩士研究生論文答辯8重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化重組梅毒螺旋體抗原重組梅毒螺旋體抗原Tp17的的表達表達Tp17抗原最佳抗原最佳 (NH4)2SO4沉淀飽和度沉淀飽和度的確定的確定離子交換層析條件的離子交換層析條件的選擇選擇與樣品的與樣品的預處

6、理預處理 SDS-PAGE分析純化結果分析純化結果純化抗原的純化抗原的濃度測定濃度測定純化抗原的純化抗原的標記標記及其及其滴度測定滴度測定 西北大學碩士研究生論文答辯9重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化重組梅毒螺旋體抗原Tp17的表達 西北大學碩士研究生論文答辯每每24 h 補加甲醇補加甲醇一次，一次，連續(xù)誘導連續(xù)誘導96 h新鮮菌落接入新鮮菌落接入25 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中30，280 r/min 培養(yǎng)過夜培養(yǎng)過夜1,500 r/min 離心離心5 min，棄上清，棄上清菌體用菌體用100 mL BMMY培養(yǎng)基懸浮，培養(yǎng)培養(yǎng)基懸浮，培養(yǎng)收集培養(yǎng)物上清收集培養(yǎng)物上清采用本實驗保存的重組體

7、對采用本實驗保存的重組體對Tp17抗原進行表達，分為生長和誘導兩個階段抗原進行表達，分為生長和誘導兩個階段10Tp17抗原最佳(NH4)2SO4沉淀濃度重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 (NH4)2SO4分級沉淀分級沉淀Tp17抗原的培養(yǎng)物上清抗原的培養(yǎng)物上清SDS-PAGE M: 標準蛋白質分子量; 1-3: 分別為70%、50%和30%濃度的(NH4)2SO4 西北大學碩士研究生論文答辯 Bradford法測定法測定70%、50%和和30% (NH4)2SO4 沉淀后的蛋白沉淀后的蛋白濃度分別為濃度分別為0.72mg/mL、 0.60mg/mL和和0.11mg/mL11選擇選擇CM高流速瓊

8、脂糖微球高流速瓊脂糖微球（CM Bio-Sep FF，pH工作范圍：工作范圍： 6-10）作為純化蛋白的層析介質，對）作為純化蛋白的層析介質，對上樣緩沖液上樣緩沖液pH值值及及洗脫緩沖洗脫緩沖液離子強度液離子強度進行了確定進行了確定SDS-PAGE對純化抗原的鑒定對純化抗原的鑒定層析系統(tǒng)的選擇 重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 西北大學碩士研究生論文答辯12重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化上樣緩沖液pH值的選擇 Tp17抗原與介質結合后的上清抗原與介質結合后的上清SDS-PAGEM: 標準蛋白質分子量; 1-5: 分別為pH為6.4、6.9、7.4、7.9和8.4的上樣緩沖液 西北大學碩士研究

9、生論文答辯當當pH值為值為6.9時，時，Tp17抗抗原溶液上清中未結合的目的原溶液上清中未結合的目的蛋白最少，這說明在該蛋白最少，這說明在該pH值值下下Tp17帶上了正電荷從而帶上了正電荷從而與與CM中的負電荷進行交換結合中的負電荷進行交換結合在了樹脂上。在了樹脂上。 13 重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化洗脫緩沖液離子強度的選擇 吸光度值 (nm)鹽離子濃度(mol/L) 層析洗脫體積 (mL)Tp17抗原的陽離子交換層析純化抗原的陽離子交換層析純化 SDS-PAGE鑒定純化的鑒定純化的Tp17抗原抗原 M: 標準蛋白質分子量; 1, 2: 峰3洗脫液 西北大學碩士研究生論文答辯在在pH 6

10、.9 、20 mmol/L PB上樣的條件下，以上樣的條件下，以0-1.0 mol/L NaCl緩沖系統(tǒng)，緩沖系統(tǒng)， 對對Tp17抗原溶液進行不連續(xù)離子濃度梯度洗脫，分離目的蛋白，并用抗原溶液進行不連續(xù)離子濃度梯度洗脫，分離目的蛋白，并用 SDS-PAGE對收集到的目的蛋白進行鑒定。對收集到的目的蛋白進行鑒定。14重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 總上樣量為總上樣量為9mLTp17樣品通過離子交換層析純化樣品通過離子交換層析純化后，經(jīng)后，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，雜蛋白基鑒定，雜蛋白基本去除，獲得了本去除，獲得了純度較高純度較高的目的蛋的目的蛋白。白。 Tp17抗原溶液純化前和純化后的抗原溶液純

11、化前和純化后的SDS-PAGE M: 標準蛋白質分子量; 1: 純化前; 2: 純化后 西北大學碩士研究生論文答辯純化放大實驗15 HRP標記Tp17抗原5 mg HRP，平衡至室溫后溶于800L 超純水中 逐滴加入新配的0.1 mol/L NaIO4溶液，攪拌20 min 1 mmol/L pH 4.4醋酸鈉緩沖液，4過夜透析升高醛化HRP的pH到9.0，待標記抗原于pH 9.5CBS中4透析2 h 抗原標記，過夜透析后(NH4)2SO4 沉淀透析后離心收集上清物即為酶結合物重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 西北大學碩士研究生論文答辯16HRP標記Tp17抗原滴度測定 包被抗原量和包被抗原量

12、和HRP- -標記抗原滴度的方陣試驗標記抗原滴度的方陣試驗重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化 西北大學碩士研究生論文答辯標記抗原稀釋度包被抗原量(ng/孔) 100200300400500 1:200PN0.5450.0000.7150.0020.9920.0001.4830.0031.3750.002 1:400PN0.7650.0010.8320.0011.0820.0001.2430.0051.3000.004 1:800PN1.0050.0001.1860.0001.7320.0021.9430.0042.5090.0021:1,600PN0.8750.0010.9470.0001.63

13、40.0031.8210.0021.9340.0001:3,200PN0.5820.0020.6340.0041.1120.0011.2010.0051.2320.0031:6,400PN0.5640.0040.6000.0030.7940.0010.8340.0001.1690.00017重組梅毒螺旋體抗原Tp17的純化表達并成功純化了梅毒螺旋體抗原表達并成功純化了梅毒螺旋體抗原Tp17。用。用CM介質介質裝成層析柱，裝成層析柱， Tp17 最佳純化條件是最佳純化條件是在在pH 6.9、20mmol/L PB 的條件下上樣，的條件下上樣， 目的抗原約在目的抗原約在0.6mol/L NaCl

14、的條件下被洗脫下來。的條件下被洗脫下來。通過通過SDS-PAGE鑒定可得到鑒定可得到高純度高純度的的Tp17，經(jīng)，經(jīng)Bradford法測定所得到法測定所得到 的蛋白濃度為的蛋白濃度為0.66mg/mL。雙抗原夾心法測定雙抗原夾心法測定HRP- -標記抗原的滴度為標記抗原的滴度為1:3,200。小結 西北大學碩士研究生論文答辯18 實驗二:以金磁微粒為載體檢測梅毒螺旋體抗體運用運用純化的純化的Tp17抗原抗原建立梅毒螺旋體抗體建立梅毒螺旋體抗體磁分離酶聯(lián)磁分離酶聯(lián)免疫免疫檢測方法檢測方法并將該方法初步應用于血液篩查并將該方法初步應用于血液篩查運用商品化重組梅毒螺旋體抗原運用商品化重組梅毒螺旋體抗

15、原Tp15、Tp17和和Tp47，完善上述方法完善上述方法梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯19金磁微粒檢測梅毒螺旋體抗體方法的建立Tp抗原抗原在金磁微粒表面的在金磁微粒表面的固定化和封閉固定化和封閉 Tp17抗原抗原用于雙抗原夾心法檢測梅毒螺旋體抗體用于雙抗原夾心法檢測梅毒螺旋體抗體臨界值臨界值的確定的確定血液篩查血液篩查中的應用中的應用商品化抗原商品化抗原Tp15、Tp17 和和Tp47用于雙抗原夾心法用于雙抗原夾心法 檢測梅毒螺旋體抗體檢測梅毒螺旋體抗體溫育時間溫育時間的選擇的選擇 精密度精密度分析分析靈敏度靈敏度分析分析血液篩查血液篩查中的應用中的應用梅毒螺旋體抗體檢測 西

16、北大學碩士研究生論文答辯203004005000.00.51.01.52.021波長/ nm1：固定前2：固定后吸光度值 固定前后抗原溶液特征吸收光譜固定前后抗原溶液特征吸收光譜 Tp抗原在金磁微粒表面的固定化和封閉梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯固定前抗原溶液在固定前抗原溶液在280 nm 處處具有明顯的光吸收，固定后具有明顯的光吸收，固定后上清液在上清液在280 nm 處無特征光處無特征光吸收，說明大部分抗原均固吸收，說明大部分抗原均固定在金磁微粒表面。定在金磁微粒表面。21Tp17抗原用于檢測梅毒螺旋體抗體條件優(yōu)選固定抗原量和固定抗原量和HRP- -標記抗原稀釋度的方陣試驗

17、標記抗原稀釋度的方陣試驗梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯標記抗原稀釋度固定抗原量(ng/孔) 300420480540600 1:200PN0.2510.0110.5020.0070.7920.0090.9830.0071.2320.0051:400PN0.3870.0050.5190.0070.8820.0090.9870.0111.3010.004 1:800PN0.5750.0040.4860.0041.5320.0021.5430.0001.5090.002 1:1,600PN0.6750.0040.7740.0001.7340.0031.7210.0041.7430.0

18、05 1:3,200PN0.5820.0020.6340.0041.3120.0011.3010.0051.4320.003由表中結果可看出：由表中結果可看出：Tp17抗原的固量抗原的固量480 ng/ /孔孔，HRP- -標記抗原的稀釋度標記抗原的稀釋度1:1,600為最優(yōu)反應條件為最優(yōu)反應條件 22臨界值的確定平均平均OD值：值：X= 0.050標標 準準 偏偏 差：差：SD = 0.014 陰性血清陰性血清OD值分布值分布 梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯按照以下方法： P/N 2.1，可以得COV = 0.105 23梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯194份

19、血樣篩查結果0.0320.1000.0870.0540.0670.0790.0960.0940.0750.0400.0650.0340.0410.0300.0540.0540.0980.0590.0990.1010.1000.0870.0260.0460.0240.0520.0850.0450.0870.0340.0640.0760.0650.0250.0750.0800.0260.0740.0920.0650.0760.0750.0870.0730.0650.0650.0450.0730.0460.0730.0620.0500.0300.0410.0630.0620.0620.0290.03

20、60.0400.0400.0510.0740.0400.0490.0540.0990.0490.0640.0690.0740.0810.0360.0400.0400.0390.0600.0410.0750.0240.0640.0340.0420.0450.0740.0770.0750.0450.0640.0430.0300.0980.0650.0430.0640.0450.0750.0450.0520.0610.0360.0630.0400.0320.0540.0340.0260.0730.0710.0460.0460.0570.0410.0730.0290.0560.0310.0350.03

21、50.0500.0420.0480.0410.0280.0410.0410.0470.0510.0700.0400.0520.0500.0500.0470.0430.0390.0600.0820.0910.0740.0790.0430.0270.0520.1020.0632.0310.0320.0950.0730.0620.0740.0350.0530.0720.0940.0340.0740.0420.0850.0840.0920.0900.0720.0770.0750.0440.0990.0350.0840.0730.0720.0560.0660.0660.0450.0820.0900.09

22、10.0760.0430.0580.0890.0730.0470.0610.0350.0740.0420.0500.0720.0720.0640.029陽性率為陽性率為0.5%，與試劑盒檢測結果一致，與試劑盒檢測結果一致24不同時期梅毒患者血清檢測結果 1.0351.0061.6321.0941.1030.9831.3210.2910.5940.9981.7011.1051.0001.1070.749梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯15例早期患者血清檢測結果例早期患者血清檢測結果15例晚期患者血清檢測結果例晚期患者血清檢測結果0.9131.1351.0641.0010.9530.

23、6010.8420.4061.0000.8540.9340.9890.0760.0400.053Tp17抗原對早期感染血清抗體更抗原對早期感染血清抗體更為敏感，對晚期感染者存在一定為敏感，對晚期感染者存在一定的漏檢，這一檢測結果與國內外的漏檢，這一檢測結果與國內外報道一致。與報道一致。與Tp15和和Tp47抗原相抗原相聯(lián)合，可提高檢測靈敏度聯(lián)合，可提高檢測靈敏度25與商品化Tp17抗原的比較 用純化用純化Tp17、商品化、商品化Tp17和商品化重組和商品化重組抗原抗原Tp15、Tp17和和Tp47分別包被金磁微粒用來檢測梅毒螺旋體抗體分別包被金磁微粒用來檢測梅毒螺旋體抗體純化抗原商品化抗原商品

24、化重組抗原陽性對照1.5391.5532.034陰性對照0.0010.0030.001抗原來源結果梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯 由表中結果可看出：單一純化抗原和商品化抗原在檢測結果上基由表中結果可看出：單一純化抗原和商品化抗原在檢測結果上基本相同，但與混合抗原相比存在一定的差別本相同，但與混合抗原相比存在一定的差別26 雙抗原夾心法方陣試驗結果雙抗原夾心法方陣試驗結果梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯標記抗原稀釋度固定抗原 量(ng/孔) 120240420480540 1：1000PN0.2280.0030.5050.0051.2780.0031.3000.00

25、71.3140.0001：2000PN0.3990.0020.6890.0071.2850.0031.5000.0101.4980.0051：3000PN0.4210.0000.6680.0041.3720.0031.3800.0031.3740.0031：4000PN0.6210.0060.9570.0101.7470.0051.7630.0041.7600.0071：5000PN0.4750.0060.5010.0070.7420.0040.7510.0050.7600.005 1：6000 P N 0.206 0.010 0.343 0.013 0.673 0.006 0.700 0.0

26、09 0.712 0.006商品化抗原Tp15、Tp17 和Tp47用于雙抗原 夾心法檢測梅毒螺旋體抗體由表可看出：金磁微由表可看出：金磁微粒表面固定抗原量粒表面固定抗原量420 ng/ /孔孔，HRP- -標記標記抗原的稀釋度抗原的稀釋度1:4,000定為最優(yōu)反應條件。定為最優(yōu)反應條件。 27 吸光度值隨溫育時間的變化吸光度值隨溫育時間的變化溫育時間的選擇 梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯 本實驗中，選用溫育時間為本實驗中，選用溫育時間為30 min，此時抗原抗體反應已達平衡，且，此時抗原抗體反應已達平衡，且時間波動對吸光度值影響較小。時間波動對吸光度值影響較小。 28精密度分

27、析 梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯批次檢測結果平均值CV值 (%)(批內-)1PN1.2620.0021.3190.0001.3630.0031.2790.0031.3360.0051.2783.232PN1.4580.0151.4000.0191.3780.0071.5060.0011.4320.0051.4013.583PN1.2530.0051.2850.0101.2190.0001.3450.0001.2460.0061.2203.964PN1.1670.004 1.2940.0031.2820.0011.2050.0101.2420.0041.1924.465PN1.

28、2850.0081.2300.0041.1980.0031.2450.0051.2760.0151.2022.94CV值(%) (批間-)6.82批內批內CV值均在值均在5%以下，批間以下，批間CV值為值為6.82%，免疫學載體，免疫學載體要求不高于要求不高于15%。表明金磁微?？勺鳛橐环N理想的梅毒螺表明金磁微?？勺鳛橐环N理想的梅毒螺旋體抗體檢測載體。旋體抗體檢測載體。29靈敏度分析 金磁微粒檢測系統(tǒng)與試劑盒靈敏度比較金磁微粒檢測系統(tǒng)與試劑盒靈敏度比較梅毒螺旋體抗體檢測 西北大學碩士研究生論文答辯稀釋度 檢測結果 金磁微粒檢測系統(tǒng) 試劑盒檢測系統(tǒng) 1:50 + + 1:100 + + 1:200 + - 1:400 + - 1:800 + - 1:1600 + - 1:3200 - - 金磁微粒檢測系統(tǒng)的靈敏度至少是商品化試劑盒靈敏度的金磁微粒檢測系統(tǒng)的靈敏度至少是商品化試劑盒靈敏度的10倍倍。30血液篩查中的應用 金磁微粒與試劑盒的符合率為金磁微粒與試劑盒的符合率為98.4% 檢測檢測1515例早期病人和例早期病人和1515例晚期病人血清，檢測結果與試劑盒和例晚期病人血清，檢測結果與試劑盒和 臨床診斷結果完全一致，運用臨床診