細胞生物學技術(shù)

1、第二章 第三章 第四章 電鏡1. 電鏡、分辨率、透射電子、二次電子、電子束、超薄切片、免疫電鏡技術(shù)電鏡 ：以電電子束為光源， 電磁場為透鏡， 利用電子散射產(chǎn)生的信號進行顯微成像的具有 高分辨率和放大倍率的顯微鏡。電鏡用于研究組織和細胞的超微結(jié)構(gòu)分辨率 ：用于表示人眼和光學儀器能夠辨別的兩點之間最小距離的標志。人0.2mm，光鏡 0.2um 。分辨率是衡量電鏡性能的重要指標。透射電子： 當樣品厚度小于 100nm 時，部分電子可穿透樣品，將穿透樣品的電子叫做透 射電子。（利用透射電子信息成像的稱為透射電鏡）二次電子： 在入射電子的轟擊下 ,樣品表面 5-50 nm 深度激發(fā)出來的電子稱為二次電子

2、。 （利用二次電子信息成像的稱為掃描電鏡）電子束： 又稱電子射線，電子束帶負電荷，具有光的波動性、可折射性。電鏡利用電子束 作為“光源”成像。超薄切片 ：將環(huán)氧樹脂包埋的組織塊切成 100nm 以下的薄切片稱為超薄切片，超薄切片 經(jīng)電子染色后在 TEM 下觀察組織細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。immune electron microscopy ：免疫電鏡技術(shù)是將免疫學方法與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合， 利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，在超微結(jié)構(gòu)水平定位特異大分子的技術(shù)。2. 電鏡在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用 觀察細胞器和組織器官的超微結(jié)構(gòu)；觀察病毒和細菌等；觀察組織細胞超微病理結(jié)構(gòu)； 用于臨床疾病的診斷；觀察生物材料復(fù)合

3、體及模式生物等3. 從分辨率、放大倍率、成像信號、樣品制備、圖像特點和應(yīng)用幾方面對透射電鏡和掃描 電鏡進行比較TEM 分辨率為 0.1nm，放大倍率是 100 萬倍，成像信號為透射電子信號成像，樣品制備 過程復(fù)雜，要制成 50 100nm 的超薄切片，圖像特點為二維結(jié)構(gòu)，平面圖像，TEM 用于觀察組織細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。SEM 分辨率為 0.6nm，放大倍率是 80 萬倍，成像信號為二次電子信號成像，樣品制備方 法較簡單，標本可大而厚，圖像特點為三維結(jié)構(gòu)圖像，立體感較強， SEM 用于觀察樣品 表面及其斷面立體形貌。4. 了解細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化應(yīng)選擇哪種類型的電鏡，為了保證良好的超微構(gòu)，在

4、樣本 取材及固定時應(yīng)注意什么？如果是培養(yǎng)細胞，細胞數(shù)量一定要達到多少？ 了解細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化應(yīng)選擇 TEM 。為保證良好的超微結(jié)構(gòu)，在樣本取材及固定時應(yīng)注意做到快、小、輕、冷?？欤涸?1 分鐘 內(nèi)固定組織，盡可能保持其生活狀態(tài)，因為瞬間的拖延都會導(dǎo)致細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。?。?組織塊必須切成 1mm3的小塊， 組織塊過大其中央得不到及時固定會發(fā)生細胞自溶現(xiàn)象。輕：不要牽拉、鋸、擠壓組織。要用銳利的刀片，避免細胞受到損傷。冷：低溫操作，4保存，降低酶的活性，避免組織發(fā)生自溶。如果是培養(yǎng)細胞，細胞數(shù)量一定要達到1× 1075. 在透射電鏡樣本取材時，樣本不可大于 1mm3 ，并在 1

5、 分鐘以內(nèi)完成固定。請問如果組 織塊過大會出現(xiàn)什么后果？沒有及時固定的組織電鏡下會出現(xiàn)何種改變？由于電鏡固定液戊二醛對組織的穿透能力較弱， 如果組織塊過大會造成組織中心得不到及 時固定， 在電鏡下沒有得到及時固定組織細胞的細胞器會發(fā)生變性， 特別是對缺血乏氧十分 敏感的線粒體會出現(xiàn)腫脹和空泡變性等改變。6. 掃描電鏡用于觀察組織表面結(jié)構(gòu)，因此取材時必需要充分暴露組織表面結(jié)構(gòu)，請問常用 的方法和注意事項有哪些？在樣品取材時必須充分暴露并保護好觀察面，避免損傷要觀察的部位，易卷曲的樣品 , 如 氣管、 胃、腸粘膜可固定在濾紙上展平， 要將表面的血液、粘液用生理鹽水或緩沖液仔細漂 洗干凈。7. 什么

6、是血管灌注固定？為什么腦、心、腎臟等組織要進行灌注固定取材？在樣品制備過 程中為什么要進行半薄切片定位？血管灌注固定是通過血管灌注適量的固定劑， 在動物體內(nèi)把活細胞在原位及時固定。 血管 灌注固定速度快， 固定均勻， 可減少離體或死亡后缺氧引起自發(fā)性的變化影響，特別是對腦、心肌、腎臟等對缺氧比較敏感的組織尤為重要。半薄切片的意義在于： 1 選取超薄切片的部位，超薄切片的面積一般要小于0.5mm2，要經(jīng)過半薄切片來選取有意義的部位。 2 對同一部位進行光、 電鏡對比觀察， 在較大范圍內(nèi)了 解組織結(jié)構(gòu)、病變部位和病理性質(zhì)，有利于更確切的認識超薄切片中的結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系。第六章 第八章1. 免疫細胞

7、化學技術(shù)間接法的優(yōu)點有哪些1 只要擁有同一種屬的一抗和標記的二抗就可以操作而不必對針對各種抗原的一抗做標 記，大大簡化了抗體的制備2 一個一抗分子可以和多個二抗分子結(jié)合，提高了靈敏度3 一抗未經(jīng)標記，可以避免標記造成的對抗體抗原結(jié)合的影響2. 免疫熒光雙標技術(shù)雙標用兩種熒光素分別顯示不同的抗原物質(zhì)，使幾種待測物質(zhì)可以由不同顏色的熒光素 在同一張組織切片上反映出來，效果非常直觀。雙標要求一抗種屬分開，二抗顏色分開。3 名解 ABC ， LSAB ，探針ABC ：親和素生物素酶復(fù)合物技術(shù)，把親和素與生物素偶聯(lián)的過氧化物酶或堿性磷酸酶 按照一定比例組合成親和素生物素酶復(fù)合物， 能保證其中的親和素有一

8、定的游離結(jié)合位 點讓生物素偶聯(lián)物質(zhì)結(jié)合。LSAB ：生物素標記的鏈球菌親和素，具有靈敏度高。特異性強，穩(wěn)定性好的優(yōu)點。此法 實驗過程中有一下幾點注意事項：封閉、使用雙氧水、顯色。探針 ：指一些序列已知或序列未知但分子已知的核酸分子。后者指的是雖不明確該分子全部序列但已知其針對何靶分子。探針主要分為，和寡核苷酸三種。親和技術(shù)原理 利用兩物質(zhì)之間親和能力而互相結(jié)合， 以定位特異分子的技術(shù)， 最常用的親和物質(zhì)系統(tǒng) 是親和素和生物素。原位雜交的應(yīng)用原理 ：使含有特異序列、 經(jīng)過標記的核酸單鏈即探針， 在適宜條件下與組織細胞中的互 補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進

9、行探測， 從而在細胞原位顯示特異的 DNA 或 RNA 分子。應(yīng)用：為什么原位雜交技術(shù)是分子細胞生物學水平技術(shù)？（原位雜交技術(shù)中如何應(yīng)用了其他幾種細胞化學技術(shù)？）第九章 流式細胞分析術(shù)1. 名解：流式細胞分析術(shù)，熒光補償； DNA 指數(shù)，增殖指數(shù) ;收獲率和純度FCM 是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、 精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù) 定量分析和分選的技術(shù)。 （層流技術(shù)保證了樣品中的每一個細胞都沿流動室中心軸運動，實 現(xiàn)了每一個細胞以相同的速度、相同方向、相同的軌跡流經(jīng)儀器檢測區(qū)。 ）熒光補償 ：目前使用的熒光素都是寬發(fā)射譜的， 相互之間有明顯重疊部分。 分束片和濾 色片等光學元件不能

10、完全解決這些問題。 實際工作中常用的方法是利用電子技術(shù)或計算機軟 件等方法將串入相鄰螢光通道的信號加以扣除。即熒光補償。DNA 指數(shù) ： DI ，用于描述樣品細胞 DNA 含量的偏離程度和倍體水平。定義為整成二 倍體細胞的 DI=1.0 ，而被測樣品的 DI 為 （被測樣品中 G0/G1 細胞 DNA 含量） /正常二倍 體 DNA 含量。增殖指數(shù) ：PI，用來反映腫瘤細胞的增殖能力。定義為樣品細胞群體中S 期細胞 G2M細胞之和占總細胞群體的百分比。收獲率 ：指分離后所得的細胞亞群數(shù)占原細胞樣品中該亞群細胞數(shù)的百分比。純度 ：指分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。2. FCM 細胞散色光信

11、號和熒光信號FCM 被測樣品中的細胞流經(jīng)了儀器檢測區(qū)時受到激發(fā)光的照射， 激發(fā)光與細胞相互作用 后可產(chǎn)生散射光信號和熒光信號。散射光信號分為前向角散射信號和側(cè)向角散射信號。前與細胞大小有關(guān)，側(cè)包含有細胞 內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)學信息。熒光信號主要指經(jīng)過特異螢光染色后細胞受照發(fā)射的熒光信號。 （ 掌握熒光的特異性以及 定量關(guān)系 ）3. FCM 的數(shù)據(jù)儲存方式、 FCM 的不同顯示方式FCM 數(shù)據(jù)儲存方式為 List Mode 。顯示方式分為單參數(shù)（直方圖） ，雙參數(shù)（散點圖、等 高線輪廓圖和假三維圖）和多參數(shù)數(shù)據(jù)顯示。直方圖 ：橫軸為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線性的，也可以是 對數(shù)的

12、?？v軸一般是細胞數(shù)或細胞出現(xiàn)的頻數(shù)。散點圖 ：在二維圖上， X 軸代表第一個測量參數(shù)， Y 軸代表第二個測量參數(shù)。每個點代表 一個細胞。等高線 ：用等高線來表示細胞數(shù)， 在一條等高線上細胞數(shù)相同， 不同的等高線上細胞數(shù)不 同。假三維 ：縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數(shù) ,Z 軸為細胞數(shù)。多參數(shù)數(shù)據(jù)顯示圖 ：三維坐標勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非細胞數(shù)。4. 比較單細胞懸液的制備過程中分散細胞的方法常用方法有酶消化法、機械法和化學試劑處理法。機械法往往常成嚴重的細胞損傷， 而結(jié)果卻是較低的細胞產(chǎn)量。 可以用低速離心去碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團塊等，也可利用電子學技術(shù)處理的方法排除團塊和碎片的干擾

13、。酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學成份的不良影響。總之 FCM 所測細胞是單個分散狀態(tài)；對細胞團塊，細胞碎片盡可能少；細胞的活性不 受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。5. 酶消化法應(yīng)注意哪些條件 ?配制酶溶液試劑時要兼顧酶反應(yīng)的適宜條件與活細胞要求的生理環(huán)境；注意酶溶液的適 用濃度；注意酶消化過程的最佳溫度與持續(xù)時間6. 讀圖：線性分布直方圖、多參數(shù)數(shù)據(jù)顯示方法P115、 P1181. 名解第十一章 圖像分析系統(tǒng)圖像分析 ：是分析細胞學技術(shù)中的重要分析手段， 是在計算機技術(shù)， 信號處理， 自控理論， 攝像技術(shù)等基礎(chǔ)上發(fā)展起來的綜合應(yīng)用技術(shù)。像素 ：構(gòu)成圖像的

14、基本元素數(shù)字圖像 ：模擬圖像經(jīng)數(shù)字化處理 （空間點陣上抽樣和顏色灰度的量化 ）后 ,所得到的灰度值 的二維數(shù)組2. 圖像分析系統(tǒng)的采圖步驟圖像輸入（確定輸入條件） -> 圖像增強（圖像像質(zhì)改善） -> 圖像分割（圖像二值化）-> 圖像整理（特征提?。?-> 圖像識別處理和測量（標尺和參數(shù)） -> 數(shù)據(jù)分析3. 圖像分析系統(tǒng)的應(yīng)用 幾何形態(tài)檢測；顯色程度表達；密度分布檢測；定性分析和定量分析細胞核漿比測量。（DNA 含量測量、 骨標本幾何參數(shù)測量、掃描電鏡（ SEM ）圖象幾何參數(shù)測量、血管參數(shù) 測量、 白血球細胞測量、 神經(jīng)軸突測量、 銀顆粒密度測量、 熒光定量測

15、試、 骨髓腔三維重建、 免疫組化測量、電泳條帶測量）其他1. 離心技術(shù) ：利用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，將不同大小的顆粒從溶液中分離，如細胞、細胞器、 病毒、大分子。包括差速離心法、沉降速度離心，又稱移動區(qū)帶（密度）離心和沉降平衡離 心，又稱等密度梯度離心。2. 差速離心法 ：通過一系列遞增速度的離心，依次將大小不同的顆粒逐級分離。分離大小 相差懸殊的細胞和細胞結(jié)構(gòu)成分。3. 移動區(qū)帶離心法 ：用梯度蔗糖或甘油作為介質(zhì)，將要分離的樣品放在介質(zhì)表面，形成一 個狹帶， 然后超速離心， 使不同大小的顆粒以不同的速度向管底方向移動， 形成一系列區(qū)帶， 從管底小孔中分次收集各種顆粒成分。 分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 分離效果 只與顆粒大小有關(guān)，與密度無關(guān)。4. 等密度梯度離心： 離心時采用包括各種顆粒密度范圍的梯度介質(zhì)，被分離顆粒達到與其 相同的密度介質(zhì)時不再移動，形成一系列區(qū)帶，然后從管底收集。分離密度不等的顆粒,適 用于病毒、 DNA 、RNA 、蛋白質(zhì)等，效果只與顆粒密度有關(guān)，與大小無關(guān)。5. 細胞培養(yǎng)技術(shù) ：從生物體內(nèi)取出細胞或組織，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當 溫度和一定營養(yǎng)條件下進行孵育培養(yǎng)，使之生存和生長，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。6. 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) : 研究體內(nèi) DNA 與蛋白質(zhì)相互作用的方法。