《PCR技術(shù)與應(yīng)用》

1、分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPCRPCR技術(shù)及其應(yīng)用技術(shù)及其應(yīng)用申川軍申川軍廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室廣州中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)教研室分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt參考書參考書美美CW迪芬巴赫迪芬巴赫GS德弗克斯勒德弗克斯勒本書由美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出本書由美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社組織國(guó)際權(quán)威實(shí)驗(yàn)室的版社組織國(guó)際權(quán)威實(shí)驗(yàn)室的專家共同研討并撰稿，是對(duì)專家共同研討并撰稿，是對(duì)其其10年前廣受贊譽(yù)的第一版年前廣受贊譽(yù)的第一版的全新修訂。全書共的全新修訂。全書共8篇，篇，分別介紹了分別介紹了PCR方法基本原方法基本原理，樣品制備

2、，引物設(shè)計(jì)，理，樣品制備，引物設(shè)計(jì)，PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，產(chǎn)物的檢測(cè)，PCR介導(dǎo)介導(dǎo)的克隆，的克隆，PCR法制備突變體，法制備突變體，以及利用以及利用PCR進(jìn)行基因的差進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，異表達(dá)分析，RNA樣品的樣品的PCR方法等。方法等。70元元分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt背景背景n由由Khorana及其同事于及其同事于1971年提出年提出：“經(jīng)過經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基因基因”。n但由于當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引但

3、由于當(dāng)時(shí)很難進(jìn)行測(cè)序和合成寡核苷酸引物，且當(dāng)時(shí)物，且當(dāng)時(shí)(1970年年)Smith等發(fā)現(xiàn)了等發(fā)現(xiàn)了 DNA限限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使以，使Khorana等的早期設(shè)想被人等的早期設(shè)想被人 們遺忘。們遺忘。 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptn年，在公司工作的年，在公司工作的Mullis著手解決著手解決用簡(jiǎn)單的方法鑒定某一段的技術(shù)問題，有一天晚用簡(jiǎn)單的方法鑒定某一段的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州號(hào)高速公路上，靈機(jī)一動(dòng)想上他驅(qū)車在北部加州號(hào)高速公路上，靈機(jī)一動(dòng)想到了一個(gè)實(shí)際上可以無限擴(kuò)增某段的簡(jiǎn)單

4、方法，到了一個(gè)實(shí)際上可以無限擴(kuò)增某段的簡(jiǎn)單方法，即。即。n在年的一次學(xué)術(shù)會(huì)議上，此方法首次被介紹，在年的一次學(xué)術(shù)會(huì)議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學(xué)家中也引起了鏈反應(yīng)。在分子生物科學(xué)家中也引起了鏈反應(yīng)。大家很快地紛紛大家很快地紛紛采用這個(gè)方法，很多人還很奇怪自己怎么沒有首先想到采用這個(gè)方法，很多人還很奇怪自己怎么沒有首先想到這么做。這么做。給了給了Mullis一萬(wàn)美元的獎(jiǎng)金，隨后一萬(wàn)美元的獎(jiǎng)金，隨后把這項(xiàng)技術(shù)的專利以三億美元的價(jià)格轉(zhuǎn)讓給另一家生物把這項(xiàng)技術(shù)的專利以三億美元的價(jià)格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。被許多科學(xué)家視為近十年來分子生高技術(shù)公司。被許多科學(xué)家視為近十年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要

5、的一項(xiàng)技術(shù)突破。物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項(xiàng)技術(shù)突破。n年，年， Kary Mullis因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。因此獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝 凱利凱利穆利斯（穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：只是一個(gè)概念，所發(fā)生的奇跡是：PCR概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的概念變成了可操作的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，變成了一項(xiàng)成熟的技術(shù)，后者又上升成為新的概念。技術(shù)，后者又上升成為新的概念。 它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。它最大的特點(diǎn)就是能不斷推出新形式。 Pa

6、ul Rabinow分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPCRPCR技術(shù)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量簡(jiǎn)稱，是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。在模板在模板DNA、引物和、引物和4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸（dNTP）存在的條件下，由耐熱）存在的條件下，由耐熱DNA聚合聚合酶（如酶（如Taq DNA聚合酶）在體外反復(fù)酶促合聚合酶）在體外反復(fù)酶促合成雙鏈成雙鏈DNA的反應(yīng)稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。的反應(yīng)稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章

7、第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt# PCR 反應(yīng)五要素：反應(yīng)五要素：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt反應(yīng)反應(yīng)pHpH值值, ,鹽離子濃度鹽離子濃度穩(wěn)定劑穩(wěn)定劑, ,增強(qiáng)劑增強(qiáng)劑Mg Mg 2 2濃度濃度過高非特異性嚴(yán)重過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物過低無擴(kuò)增產(chǎn)物濃度適當(dāng)濃度適當(dāng)避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融* * 反應(yīng)體系對(duì)反應(yīng)體系對(duì)PCRPCR擴(kuò)增的影響擴(kuò)增的影響分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt # 反應(yīng)分為三步：反應(yīng)分為三步： DNA模板模板變性變性 (denaturing)單鏈單鏈DNA模板與引物模板與引物退

8、火退火 (annealling)55引物引物延伸延伸(extension)70-72左右，為左右，為Taq酶最適反應(yīng)溫度。酶最適反應(yīng)溫度。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt# PCR原理：原理：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt* * 30 30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量No.ofNo.AmpliconCycles Copiesof122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cyc

9、le = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon8 cycle = 256 Amplicon分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt# PCR實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法1. 向無菌的向無菌的200或或500l Eppendorf管中依次加入以下溶液管中依次加入以下溶液n反應(yīng)物反應(yīng)物 體積體積 n10buffer 2.5l ndNTP(1mM) 2.5l n引物引物 2l n模板模板 (20ng) 4lnTaq酶酶 (1U/u

10、l) 1ln總體積總體積 25l分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt2. 反應(yīng)體系混勻，離心反應(yīng)體系混勻，離心3. 在在PCR儀上設(shè)定以下程序：儀上設(shè)定以下程序：4. 取取20l反應(yīng)液加反應(yīng)液加4l Loading buffer在在1.2瓊瓊脂糖凝膠上脂糖凝膠上90-120V，電泳，電泳30-50min。5. 在凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)上觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果在凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)上觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果 94預(yù)變性預(yù)變性3-5min94變性變性30s55退火退火30s30個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)72延伸延伸1min72延伸延伸10min分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技

11、術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt# PCR的種類的種類 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR） 反向反向PCR（inversePCR） 嵌套式嵌套式PCR（nestingPCR） 原位原位PCR（insituPCR） 熒光定量熒光定量PCR（fluorescentquantitativePCR） 多重多重PCR（multiplexPCR） 實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR（Real-timePCR） 多重等位基因多重等位基因PCR（multiplex

12、allelePCR） 不對(duì)稱不對(duì)稱PCR（asymmertricPCR） 錨定錨定PCR（anchoredPCR） 長(zhǎng)片段長(zhǎng)片段PCR（longfragmentPCR） 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴(kuò)增RT-PCRRT-PCR分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt反向反向PCR- PCR- cDNA cDNA 5-端的快速擴(kuò)增/5-RACE分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交

13、技術(shù)編輯ppt5RACE的實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)方法-PSPtetRNA的的5末端末端 體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄PSPtet RNAPSPtet RNA。 配制配制PSPtet RNAPSPtet RNA和人總和人總RNARNA的混合樣品。的混合樣品。 設(shè)計(jì)合成設(shè)計(jì)合成5 5條引物。條引物。 使用使用5 RACE5 RACE法獲取法獲取PSPtet RNAPSPtet RNA的的55末末端。端。 切膠回收目的切膠回收目的DNADNA片段。片段。 進(jìn)行進(jìn)行DNADNA測(cè)序確認(rèn)序列結(jié)果。測(cè)序確認(rèn)序列結(jié)果。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子

14、雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPSPtetRNA的電泳結(jié)果的電泳結(jié)果1：PSPtetRNAM：DL2,000Marker1 M分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptRNAMixture的配制的配制將將PSPtet RNAPSPtet RNA與人總與人總RNARNA按按1 1 ：10105 5 的比例混合，此混的比例混合，此混合物用于合物用于5 RACE5 RACE實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt人總?cè)丝俁NA的電泳結(jié)果的電泳結(jié)果1M1:HumanTotalRNAM:HindIIIMarker分子生物學(xué)分子生物學(xué)

15、第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPSPtetRNA的的5端序列端序列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAG

16、CGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGC

17、CGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCC

18、TGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt五條引物與五條引物與PSPtetRNA的位置關(guān)系圖的位置關(guān)系圖未知未知序列序列53分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt5條引物的詳細(xì)序列條引物的詳細(xì)序列RTPrimer：5-(p)AAAATGACCCAG-3F1Primer：5-GTCCTGTGGATCCTCTACGC-3R1Primer：5-AGCCAC

19、TATCGACTACGCGAT-3F2Primer：5-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG-3R2Primer：5-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA-3分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptStep1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RNAMixture10RTBufferRNaseInhibitor(40U/m ml)AMVReverseTranscriptaseXL(5U/m ml)5磷標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄引物磷標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄引物(200pmol/m ml)RNaseFreedH2Oupto3010分鐘分鐘5030分鐘分鐘802分鐘分鐘4保存

20、保存1.1.反應(yīng)液組成反應(yīng)液組成: :2.2.反應(yīng)條件反應(yīng)條件: :3.0m mg1.5m ml0.5m ml1.0m ml1.0m ml15m ml分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptStep2.HybridRNA的分解的分解1stStrandcDNA反應(yīng)液反應(yīng)液5HybridRNADegenerationBufferRNaseH(60U/m ml)dH2Oupto30;1小時(shí)小時(shí)乙醇沉淀乙醇沉淀1.1.反應(yīng)液組成反應(yīng)液組成: :2.2.反應(yīng)條件反應(yīng)條件: :15m ml15m ml1m ml75m ml分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜

21、交技術(shù)編輯pptStep3.單鏈單鏈cDNA的自身連接反應(yīng)的自身連接反應(yīng)Step2的的cDNA沉淀物沉淀物5RNA(ssDNA)LigationBufferdH2O40%PEG#6000T4RNALigase(40U/m ml)16;過夜反應(yīng)過夜反應(yīng)1.1.反應(yīng)液組成反應(yīng)液組成: :2.2.反應(yīng)條件反應(yīng)條件: :8m ml12m ml20m ml1m ml分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptStep4.PCR反應(yīng)反應(yīng)(1stPCR)Step3的連接反應(yīng)液的連接反應(yīng)液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF1(20

22、mM)PrimerR1(20mM)TaKaRa LA Taq (5U/m ml)dH2Oupto1.1.反應(yīng)液組成反應(yīng)液組成: :2.2.反應(yīng)條件如下反應(yīng)條件如下: :1.0m ml5.0m ml8.0m ml0.5m ml0.5m ml0.5m ml50m ml943min9430sec5530sec7230sec25Cycles分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptStep4.PCR反應(yīng)反應(yīng)(2ndPCR)1stPCR 反應(yīng)液反應(yīng)液10LAPCRBufferIIdNTPMixture(2.5mMeach)PrimerF2(20mM)PrimerR2(20mM

23、)TaKaRa LA Taq (5U/m ml)dH2Oupto1.1.反應(yīng)液組成反應(yīng)液組成: :2.2.反應(yīng)條件如下反應(yīng)條件如下: :1.0m ml5.0m ml8.0m ml0.5m ml0.5m ml0.5m ml50m ml9430sec5530sec7230sec30Cycles分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt2ndPCR反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)結(jié)果M 1M 1M:DL2000Marker1：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt切膠回收電泳結(jié)果如下切膠回收電泳結(jié)果如下1：回收：回收DNA片段片段M：DL2000

24、Marker1MStep5.目的目的DNA片段的切膠回收片段的切膠回收分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptStep6.DNA片段的序列測(cè)定片段的序列測(cè)定分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt未知未知序列序列53測(cè)序結(jié)果與測(cè)序結(jié)果與五條引物五條引物間的關(guān)系間的關(guān)系分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPSPtetRNA的的5端序列端序列AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTA

25、AATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGA

26、CCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGA

27、TGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編

28、輯ppt差異顯示差異顯示PCRn又名又名mRNA 差異顯示差異顯示PCR（mRNA differential display PCR，DD-PCR）n又名差異顯示反轉(zhuǎn)錄又名差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（ differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt某組織總某組織總mRNA12種種3錨定引物錨定引物（T12MA、T12MG、T12MC、T12MT）反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶12種種cDNA第一鏈第一鏈2426種種5十聚隨機(jī)引物分別與十聚隨機(jī)引物分別與第一鏈進(jìn)行第一鏈進(jìn)行PCR反

29、應(yīng)反應(yīng)(288312次次)Taq聚合酶聚合酶cDNA雙鏈雙鏈可獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)所有可獲得哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)所有cDNA的片段的片段M=G、C、A分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt（熒光）定量（熒光）定量PCR概念：概念： 以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)過程的監(jiān)測(cè)，對(duì)測(cè)，對(duì)PCR起始模板量的定量。起始模板量的定量。分類：分類： 分為三大類，即分為三大類，即外標(biāo)方法外標(biāo)方法、動(dòng)動(dòng)力學(xué)方法力學(xué)方法、內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法。

30、分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt 外標(biāo)法定量外標(biāo)法定量PCRPCR：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt原理原理Taq酶：酶： 用于熒光定量用于熒光定量 PCR 的的Taq酶不酶不僅具有僅具有DNA 聚合酶活性（延伸聚合酶活性（延伸DNA引物），而且具有引物），而且具有 5 3 核酸外切核酸外切酶活性，可以在延伸過程中實(shí)現(xiàn)鏈酶活性，可以在延伸過程中實(shí)現(xiàn)鏈替換，并將被替換的單鏈切斷。替換，并將被替換的單鏈切斷。外標(biāo)法外標(biāo)法TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技

31、術(shù)編輯ppt 5端標(biāo)記端標(biāo)記信號(hào)基團(tuán)或信號(hào)基團(tuán)或報(bào)告基團(tuán)報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R)，單獨(dú)單獨(dú)存在時(shí)可以發(fā)光存在時(shí)可以發(fā)光(FAM、VIC) 3端標(biāo)記熒光抑制基團(tuán)端標(biāo)記熒光抑制基團(tuán)（Quencher，Q），），Q基基團(tuán)對(duì)團(tuán)對(duì)R基團(tuán)有抑制作用，基團(tuán)有抑制作用，存在時(shí)可抑制存在時(shí)可抑制R基因的功基因的功能，不產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象能，不產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象 當(dāng)溶液中有當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針可與模板的特異序產(chǎn)物時(shí)，該探針可與模板的特異序列結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間列結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間 當(dāng)當(dāng)Taq酶靠近探針時(shí)，酶靠近探針時(shí)，激活了激活了Taq酶的外切酶活性，酶的外切酶活性，將探針將探針5的的R切

32、下，切下，R基團(tuán)發(fā)出熒光基團(tuán)發(fā)出熒光 根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量（同步指數(shù)增長(zhǎng)）根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量（同步指數(shù)增長(zhǎng)）原理原理熒光標(biāo)記的基因探針：熒光標(biāo)記的基因探針：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt 信信號(hào)號(hào)基基因因R抑制基因抑制基因分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt Rn值是表示在各個(gè)反應(yīng)循環(huán)數(shù)儀器所檢測(cè)的熒光信號(hào)值值是表示在各個(gè)反應(yīng)循環(huán)數(shù)儀器所檢測(cè)的熒光信號(hào)值分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯pptPCR高

33、靈敏性高靈敏性光譜技術(shù)光譜技術(shù)高精確性高精確性高靈敏性高靈敏性高特異性高特異性高精確性高精確性DNA雜交雜交高特異性高特異性特點(diǎn)特點(diǎn)： 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt致突變致突變PCRM. Smith加拿大生物化學(xué)家加拿大生物化學(xué)家發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) “定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變”源頭創(chuàng)新、革命性、突破性。源頭創(chuàng)新、革命性、突破性。對(duì)基因?qū)W、基因組學(xué)及蛋白對(duì)基因?qū)W、基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的研究具有巨大影響組學(xué)的研究具有巨大影響1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt隨心所欲地在已知隨心所欲地在已知DNA序列中序

34、列中取代、插入或缺失一定長(zhǎng)度的核苷取代、插入或缺失一定長(zhǎng)度的核苷酸片段，改變?cè)行蛄械奶卣鳌Ｋ崞?，改變?cè)行蛄械奶卣?。定向性、可選擇性、定向性、可選擇性、無無(少少)干擾性、干擾性、可靠性、高效率、可靠性、高效率、簡(jiǎn)易性、可重復(fù)性簡(jiǎn)易性、可重復(fù)性特點(diǎn)：特點(diǎn)：定義：定義：分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt原位PCR Hasse等于等于1990年建立。年建立。 是指在組織細(xì)胞里進(jìn)行是指在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特了具有細(xì)胞定位能力的原位雜

35、交和高度特異敏感的異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。 原位原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，分子水又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，分子水平和細(xì)胞水平研究并重。平和細(xì)胞水平研究并重。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt 分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt 組織處理有何要求：組織處理有何要求：處理后的標(biāo)本，既要保持組織，細(xì)胞處理后的標(biāo)本，既要保持組織，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并增加細(xì)胞膜通透性，又要的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并增加細(xì)胞膜通透性，又要充分暴露擬擴(kuò)增的目的充分暴露擬擴(kuò)增的目的DNA或或RNA，使引，使引物、探針能有效進(jìn)入胞漿中發(fā)生反應(yīng)。物、探針能有效進(jìn)入胞漿中發(fā)生反應(yīng)。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 第五章第五章 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)編輯ppt 原位原位PCR的實(shí)驗(yàn)過程：的實(shí)驗(yàn)過程：實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包