分子生物學(xué)研究法

1、 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院分分 子子 生生 物物 學(xué)學(xué)2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2第六章第六章 分子生物學(xué)研究法（下）分子生物學(xué)研究法（下）基因功能研究技術(shù)基因功能研究技術(shù)2022-1-22南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院3第六章第六章 分子生物學(xué)研究法（下）分子生物學(xué)研究法（下）2022-1-23南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院從從20世紀中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速世紀中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是

2、研究方法，特別是基因操作發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。和基因工程技術(shù)的進步?；虿僮髦饕ɑ虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分擴增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院4第六章第六章 分子生物學(xué)研究法（下）分子生物學(xué)研究法（下）v內(nèi)容：內(nèi)容：n 基因表達研究技術(shù)n 基因敲除技術(shù)n 蛋白質(zhì)及

3、RNA相互作用技術(shù)n 基因芯片及數(shù)據(jù)分析1. 其他分子生物學(xué)技術(shù)2022-1-24南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院5第一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術(shù)基因表達研究技術(shù)1. 基因表達系列分析技術(shù)（基因表達系列分析技術(shù)（SAGE）v SAGE是以是以DNA序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達 模式的模式的技術(shù)。任何長度超過技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基的核個堿基的核 苷酸片段都可能代表苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物，因此，根據(jù)某個序列占總標(biāo)簽數(shù)物，因此，根據(jù)某個序列

4、占總標(biāo)簽數(shù)的比例的比例 可分析所對應(yīng)基因的表達頻率?？煞治鏊鶎?yīng)基因的表達頻率。 v LongSAGE技術(shù)。標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物技術(shù)。標(biāo)簽來自轉(zhuǎn)錄物3端一段端一段21bp的序列，的序列，可可 以進行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹以進行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹 配。其原理配。其原理與與ShortSAGE方法類似，只是方法類似，只是 用了不同的用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程），并將程 序做了相應(yīng)修改。序做了相應(yīng)修改。2022-1-25南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院6常規(guī)常規(guī)SAGE方法方法

5、 （short SAGE）基本基本 流程流程2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院7第一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術(shù)基因表達研究技術(shù)2 RNA的選擇性剪接技術(shù)的選擇性剪接技術(shù)v RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從 一個一個mRNA前前體產(chǎn)生不同的體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)剪接異構(gòu) 體的過程?？煞譃椋浩胶饧趔w的過程?？煞譃椋浩胶饧羟?、切、5選擇性剪選擇性剪 切、切、3選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相相 互排斥性剪切。常用互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基法研究某個基 因是否存在因是否存在選擇

6、性剪切。選擇性剪切。2022-1-27南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 果蠅果蠅Dscam基因可基因可 以通過可以通過可變 剪 接 產(chǎn) 生變 剪 接 產(chǎn) 生38000多種可能多種可能的的mRNA異構(gòu)體異構(gòu)體2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院8選擇性剪切的不同類型選擇性剪切的不同類型 RT-PCR檢測檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切調(diào)控因子基因的選擇性剪切2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院9第一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術(shù)基因表達研究技術(shù)3. 原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)v 原位雜交（原位雜交（IS

7、H）是）是 用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射非放射 檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體 上對上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手核酸進行定位和相對定量研究的一種手 段，分為段，分為RNA和染和染色體原位雜交兩大類。色體原位雜交兩大類。v RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高原位雜交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定）標(biāo)記的特異性探針與被固定 的組織切片反應(yīng)，若細胞中的組織切片反應(yīng)，若細胞中存在與探針互補存在與探針互補 的的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈分子，兩者雜交

8、產(chǎn)生雙鏈RNA，可可 通過放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基通過放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基 因的表達因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。產(chǎn)物做出定性定量分析。2022-1-29南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院10mRNA的互補鏈，的互補鏈， 雜 交 信 號 集 中 于雜 交 信 號 集 中 于 纖維細胞中。纖維細胞中。負對照，負對照，mRNA的的 同義同義鏈鏈, 無雜交無雜交 信號信號正對照，正對照，UBQ10雜交信雜交信號遍布于號遍布于 整個整個胚珠胚珠2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院

9、生命科學(xué)學(xué)院11第一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術(shù)基因表達研究技術(shù)3. 原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)v 熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）v 首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記， 然后用原位雜然后用原位雜交法與靶染色體或交法與靶染色體或DNA上特定上特定 的序列結(jié)合，再通過與熒光的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的素分子相耦聯(lián)的 單克隆抗體來確定該單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上序列在染色體上的的 位置。位置。2022-1-211南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院12第

10、一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術(shù)基因表達研究技術(shù)4. 基因定點突變技術(shù)基因定點突變技術(shù)v 通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所 編碼的氨基酸編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨序列，用于研究某個（些）氨 基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)催化活性以及結(jié) 合配體能力的影響，也可用于改造合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)調(diào)控控 元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。v 目前，主要采用兩種目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技方法，重疊延伸技 術(shù)和大引物誘術(shù)和大引物誘變法

11、，在基因序列中進行定點變法，在基因序列中進行定點 突變。突變。2022-1-212南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院13 寡核苷酸寡核苷酸介導(dǎo)的介導(dǎo)的 DNA突變技突變技 術(shù)術(shù)2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院14重疊延伸介導(dǎo)的定點誘變重疊延伸介導(dǎo)的定點誘變大引物誘變法大引物誘變法2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院15第二節(jié)第二節(jié) 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)1. 基本原理基本原理v 經(jīng)典遺傳學(xué)（經(jīng)典遺傳學(xué)（Forward genetics）是從一）是從

12、一 個突變體的表個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而型出發(fā)，研究其基因型，進而 找出該基因的編碼序列。找出該基因的編碼序列。v 現(xiàn)代遺傳學(xué)（現(xiàn)代遺傳學(xué)（Reverse genetics，反向遺傳，反向遺傳 學(xué)）首先從基學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型， 進而推導(dǎo)出該基因的功能。進而推導(dǎo)出該基因的功能。v 基因敲除（基因敲除（gene knock-out）又稱基因打）又稱基因打 靶，通過外源靶，通過外源DNA與染色體與染色體DNA之間的同源重之間的同源重 組，進行精確的定點修組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有飾和基因改造，具有 專一性強、染色體專一性強、染色體

13、DNA可與目的片段可與目的片段共同穩(wěn)共同穩(wěn) 定遺傳等特點。定遺傳等特點。2022-1-215南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院1. 基本原理基本原理v 基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。全基因敲除）兩種。n完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性n條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時 間和空間的基因敲除。v 噬菌體的噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母系統(tǒng)、酵母 細胞的細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常系統(tǒng)是現(xiàn)階段常

14、 用的四種定位重組用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)系統(tǒng) 應(yīng)用最為廣泛。應(yīng)用最為廣泛。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院162022-1-216南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院17用取代型（用取代型（a）或插入型（）或插入型（b）載體進行完全基因敲除實驗）載體進行完全基因敲除實驗2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院18正負篩選法（正負篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細胞法）篩選已發(fā)生同源重組的細胞第二節(jié)第二節(jié) 基因敲除技術(shù)

15、基因敲除技術(shù)2. 高等動物基因敲除技術(shù)高等動物基因敲除技術(shù)v 真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建 重組基因載重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法體，用電穿孔、顯微注射等方法 把重組把重組DNA導(dǎo)入胚胎干導(dǎo)入胚胎干細胞純系中，使外細胞純系中，使外 源源DNA與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部與胚胎干細胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)分發(fā) 生同源重組，將重組載體中的生同源重組，將重組載體中的DNA序列整序列整 合到內(nèi)源合到內(nèi)源基因組中并得以表達?；蚪M中并得以表達。v 顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對大些。 電穿孔法命電穿孔法命中率比顯

16、微注射低，操作使用方中率比顯微注射低，操作使用方 便。便。v 胚胎干細胞（胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的細胞）分離和體外培養(yǎng)的 成功奠定了哺成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院192022-1-219南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院20 模式動物小鼠模式動物小鼠中完全基因敲除的中完全基因敲除的主要技術(shù)主要技術(shù) 策略與策略與應(yīng)用。應(yīng)用。第二節(jié)第二節(jié) 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù)3. 植物基因敲除技術(shù)植物基因敲除技術(shù)v

17、 T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最 為廣泛的基為廣泛的基因敲除手段。因敲除手段。v 利用根癌農(nóng)桿菌利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報 告基因的告基因的DNA序列整合到基因組序列整合到基因組DNA上，如上，如 果這段果這段DNA插入到目插入到目的基因內(nèi)部或附近，就的基因內(nèi)部或附近，就 會影響該基因的表達，從而使該會影響該基因的表達，從而使該基因基因“失失 活活”。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院212022-1-221南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

18、南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院22植物基因敲除及突變體篩選植物基因敲除及突變體篩選 a.引物設(shè)計。引物設(shè)計。LP和和RP分別代表插入基因兩端的引分別代表插入基因兩端的引物，物，LB是指載體上的一段是指載體上的一段 引物，目的基因片段引物，目的基因片段(設(shè)為設(shè)為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的序后獲得的DNA序列。序列。 b. PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和分別代表野生型、雜合子和純合子純合子PCR條帶。條帶。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)1. 酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)v 酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀酵母單雜交

19、系統(tǒng)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定結(jié)合于蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列文庫直接獲得靶序列相互作用相互作用 蛋白的編碼基因。蛋白的編碼基因。v 將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（Pmin）的上）的上游，把報告基因連接到游，把報告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDN

20、A與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達載體）融合表達載體導(dǎo)入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)導(dǎo)入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活合，就能激活 Pmin啟動子，使報告基因得到表達。啟動子，使報告基因得到表達。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院232022-1-223南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院24從擬南芥從擬南芥cDNA文庫中文庫中 篩選與順式元篩選與順式元 件件DRE結(jié)結(jié)合的合的 轉(zhuǎn)錄因子示意圖。轉(zhuǎn)錄因子示

21、意圖。 酵母單雜交的基本酵母單雜交的基本原理示意圖原理示意圖第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)2. 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)v 真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu) （modular）特）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以征，這些蛋白往往由兩個或兩個以 上相互獨立的結(jié)構(gòu)域上相互獨立的結(jié)構(gòu)域，其中，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （binding domain，BD）和轉(zhuǎn)）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域錄激活結(jié)構(gòu)域 （activation domain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮因子發(fā)揮 功能所必須的。功能所必須的。v BD能與特定基因啟動

22、區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn) 錄，由錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和和AD所形成的雜合所形成的雜合 蛋白卻能行蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。使激活轉(zhuǎn)錄的功能。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院252022-1-225南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院26 酵母雙雜交的基本原理示意圖酵母雙雜交的基本原理示意圖第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)3. 體外蛋白質(zhì)相互作體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)用技術(shù)v Far Wes

23、tern印跡技術(shù)印跡技術(shù)v 用用32P標(biāo)記的體外表達標(biāo)記的體外表達蛋白作探針蛋白作探針,直接檢測直接檢測 與該蛋白發(fā)生相互作用與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達該蛋白的蛋白或表達該蛋白 的的cDNA。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院272022-1-227南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)3. 體外蛋白質(zhì)相互作用體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)技術(shù)v GST融合蛋白沉降技術(shù)融合蛋白沉降技術(shù)v 利用利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親的瓊脂糖球珠的親 和性，和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中

24、純化從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作得到相互作 用蛋白。用蛋白。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院282022-1-228南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)3. 體外蛋白質(zhì)相互作用體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)技術(shù)v 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)v 蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的模篩選蛋白之間的 相互作相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)白與蛋白質(zhì) 芯片孵育，洗芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可，可 以通過掃描芯片上

25、的以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相熒光點檢測到穩(wěn)定的相 互互作用蛋白點。作用蛋白點。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院292022-1-229南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)3. 體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)v 等離子表面共振技術(shù)等離子表面共振技術(shù)v 將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米 級厚度的金屬級厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過 時，如果有蛋白質(zhì)同時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌誘餌”蛋白發(fā)生相互作用

26、，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折 射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院302022-1-230南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)3. 體外蛋白質(zhì)相互作用技體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)術(shù)v 免疫共沉淀技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)v 將靶蛋白的抗體連接到固體將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可基質(zhì)上，再將可 能與靶蛋能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入白加入 反應(yīng)體系中，

27、用低反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法離心力沉淀或微膜過濾法 在固體基質(zhì)和抗體的共同作在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合用下將蛋白復(fù)合 物沉淀到物沉淀到試管的底部或微膜上。試管的底部或微膜上。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院312022-1-231南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)4. 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（移法（FRET）v FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：n給體與受體在合適的距離（1

28、10 nm）；n給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有 一定的重疊（這是能量匹配的條件）；n給體與受體的偶極具有一定的空間取 向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院322022-1-232南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)5. RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用干涉）技術(shù)及其應(yīng)用v RNAi技術(shù)利用雙鏈小技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解高效、特異性降解 細胞內(nèi)同源細胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基

29、因缺失的表型。型。RNAi的命名來源于安德魯?shù)拿麃碓从诎驳卖敺柗?998年在年在自然自然雜雜志上的志上的 論文。論文。v 研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是是RNAi的觸發(fā)物，引的觸發(fā)物，引 發(fā)與之互補的發(fā)與之互補的單鏈單鏈RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。）的降解。v 經(jīng)過經(jīng)過Dicer（一種具有（一種具有RNAase III活性的核酸活性的核酸 酶）的加工酶）的加工，細胞中較長的雙鏈，細胞中較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降個核苷酸以上）首先被降解形成解形成2125個核苷個核苷 酸的小分子干擾核糖核酸（酸的小分子干擾核糖核酸（siRN

30、A，short interfering RNA ），并有效定位目標(biāo)），并有效定位目標(biāo) mRNA。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院332022-1-233南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院34 RNAi作用機作用機 制制示意圖。示意圖。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)相互作用技術(shù)5. RNAi（RNA干干 涉）技術(shù)及其應(yīng)用涉）技術(shù)及其應(yīng)用v siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性 RNA降解的降解的重要中間媒介，它具有特殊的結(jié)重要

31、中間媒介，它具有特殊的結(jié) 構(gòu)特征，即構(gòu)特征，即5端磷酸基端磷酸基團和團和3端的羥基，其端的羥基，其 兩條鏈的兩條鏈的3端各有兩個堿基突出于末端各有兩個堿基突出于末端。端。v 由由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為 RNA誘導(dǎo)的沉誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（默復(fù)合體（RISC）的核蛋白）的核蛋白 體，再由體，再由RISC介導(dǎo)切割目的介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與分子中與 siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶擾靶 基因表達的功能?；虮磉_的功能。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院352022-1-235南京農(nóng)業(yè)大

32、學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第四節(jié)第四節(jié) 基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析v基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析v 基因芯片（基因芯片（DNA chip），又稱），又稱DNA微陣列微陣列 （DNA microarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶 基因表達的實驗基因表達的實驗手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄或細胞中各種轉(zhuǎn)錄 本的變化規(guī)律。本的變化規(guī)律。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院362022-1-236南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)

33、院生命科學(xué)學(xué)院2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院37v基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析v 簡易基因芯片簡易基因芯片v 使用機械臂把使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼龍膜片段點在玻璃片或尼龍膜 上，經(jīng)過物上，經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以理吸附作用達到固定化。也可以 直接在玻璃板表面進行直接在玻璃板表面進行化學(xué)合成，從而得到化學(xué)合成，從而得到 寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的的cDNA 或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處 理理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組，便可以觀察到大規(guī)模的

34、基因群在不同組 織或同一組織織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件不同發(fā)育時期或不同生理條件 下的表達模式。下的表達模式。v 基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人 特定組織特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信 號圖，用可疑病人號圖，用可疑病人的的cDNA做探針與之雜交，確做探針與之雜交，確 定哪些基因的表達受抑制或定哪些基因的表達受抑制或激活。激活。2022-1-237南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第五節(jié)第五節(jié) 其他分子生物學(xué)技術(shù)其他分子生物學(xué)技術(shù)1. 凝膠滯緩實驗?zāi)z滯緩實驗v 凝膠滯緩試驗（

35、凝膠滯緩試驗（gel retardation assay），）， 又叫作又叫作DNA遷移率變動試驗（遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay），是用于），是用于體外研究體外研究DNA與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì) 相互作用的一種特殊的凝膠電泳相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。技術(shù)。v 在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA 朝正電極朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反移動的距離與其分子量的對數(shù)成反 比。如果此時比。如果此時DNA分分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合， 那么，由于分子量增大，它在那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作凝膠中的遷移作 用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電朝正電 極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。極移動的距離也就相應(yīng)縮短了。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院382022-1-238南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院第五節(jié)第五節(jié) 其他分子生物學(xué)技術(shù)其他分子生物學(xué)技術(shù)v擬南芥轉(zhuǎn)擬南芥轉(zhuǎn)錄錄 因子與因子與不同不同 DNA元件元件有不同的有不同的結(jié)合能力結(jié)合能力。2022-1-2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院392