λ噬菌體載體及其衍生載體

1、噬菌體載體及其衍生載體 現(xiàn)有的噬菌體載體及其衍生載體(如cosmid, phagemid載體)都是以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建完成的。為了更好地了解噬菌體載體及其衍生載體的特點(diǎn)和優(yōu)越性，下面我們對噬菌體特性舉行容易地介紹。 (一)噬菌體 噬菌體是一種以大腸桿菌為宿主菌、具有極強(qiáng)感染能力的病毒。噬菌體通常具有溶源和溶菌兩種不同的生長途徑。在溶源狀態(tài)下，噬菌體能夠通過pop基因的位點(diǎn)專一性重組整合在大腸桿菌的染色體上，以原噬菌體的形式長久埋伏在大腸桿菌中，隨著大腸桿菌繁殖舉行不斷的復(fù)制。在一定的條件下，噬菌體也能夠轉(zhuǎn)入溶菌狀態(tài)，裂解大腸桿菌完成自我包裝過程。 野生型噬菌體dna是一種線狀的dna分子，全長大

2、約為48kb。噬菌體染色體上的基因主要包括以下幾種。噬菌體頭部合成基因。編碼a, w, b, c, d, e, f 7種不同蛋白質(zhì)，分布在噬菌體的左側(cè)。噬菌體的尾部合成基因。編碼z, u, v, g, h,m, l,k,i,j 10種不同蛋白質(zhì)。與噬菌體的整合、重組等功能有關(guān)的基因，如位于噬菌體中部的att, int, gam, red, six基因等。與噬菌體的表達(dá)調(diào)控有關(guān)的基因，如c、n, c、cro和c等位于噬菌體右半部分的基因。其他與噬菌體合成有關(guān)的基因。包括與dna合成有關(guān)的o, p,s,r基因等。 在上述基因中，有些基因可以缺失但不影響噬菌體的基本功能。因此，在野生型噬菌體改造成為

3、噬菌體載體的過程中，大量的非必須區(qū)段被剔除。這些缺失的區(qū)段包括j基因到n基因之間的區(qū)段以及p基因到q基因之間的區(qū)段，這些區(qū)段的總長度可以達(dá)到20kb左右。因?yàn)檫@些區(qū)段的剔除，噬菌體載體的可裝載外源基因片段隨之增強(qiáng)。 野生型噬菌體dna的兩側(cè)具有2個黏性末端(由12個核苷酸組成)，稱為cos位點(diǎn)。噬菌體侵染大腸桿菌以后，cos、位點(diǎn)能夠?qū)⒕€性分子銜接成為環(huán)狀的dna分子。環(huán)狀的dna分子被噬菌體頭尾蛋白包裝形成一個完整的噬菌體顆粒。通常而言，當(dāng)兩個cos位點(diǎn)之間的dna長度為野生型dna分子大小的75105，即3651kb才干完成上述過程。換而言之，剔除非必須基因后的噬菌體載體的可裝載外源基因片

4、段普通為823kb。 野生型噬菌體染色體上還具有大量的限制性內(nèi)切位點(diǎn)，已經(jīng)知道野生型噬菌體上具有50多個限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。這些限制性內(nèi)切位點(diǎn)也需要剔除才干改造成為基因克隆的載體。有關(guān)的詳細(xì)剔除過程在此不加詳述。 除了上述2個改造過程之外，按照基因克隆載體的基本要求，野生型噬菌體還需要經(jīng)過以下改造方能成為可供用法的工具載體(圖8-2)。引入可供篩選的標(biāo)志基因。常用的標(biāo)志基因是能夠在iptg和x-gal存在的狀況下的lac基因，通過互補(bǔ)現(xiàn)象來確立是否是重組的噬菌體個體。載體片段的銜接。將上述片段根據(jù)一定的方向加以銜接，然后將載體舉行環(huán)化，將環(huán)化以后的載體轉(zhuǎn)入到宿主菌中舉行繁殖。 圖8-2已經(jīng)構(gòu)

5、建完成的噬菌體載體tripx2 (二)cosmid載體 盡管噬菌體載體克隆外源片段的長度可以達(dá)到20kb，但是在實(shí)際用法過程中最長的片段也只能達(dá)到10kb左右。此外，噬菌體載體不能夠舉行大量的擴(kuò)增和繁殖，因此要獲得大量噬菌體載體dna舉行基因工程操作很困難。針對這個缺陷，1978年j. collins和b. hohn等進(jìn)展出一種新的克隆載體cosmid載體。這種克隆載體具有噬菌體的優(yōu)點(diǎn)，同時又結(jié)合了大腸桿菌質(zhì)粒的一些特點(diǎn)(可以在大腸桿菌中繁殖，便利載體dna的抽提)。這種載體本身含有噬菌體的。cos位點(diǎn)以及質(zhì)粒的一些元件，因此被稱為cosmid載體。 cosmid載體與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比

6、具有以下特點(diǎn)。 (1) cosmid載體具有a噬菌體的cos位點(diǎn)，cos位點(diǎn)舉行互相銜接以后能夠像噬菌體一樣，高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。cosmld載體進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞以后，因?yàn)槠溲b載有外源片段的載體上具有兩個cos位點(diǎn)，所以能夠?qū)崿F(xiàn)自身的環(huán)化過程。 (2)cosmld載體上沒有噬菌體生長的所有須要基因，不能夠產(chǎn)生溶菌和溶源周期，因此cosmid載體不能夠產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。但是，cosmld載體可以通過添加頭尾蛋白完成包裝過程。 (3) cosmid載體具有質(zhì)粒載體的自我復(fù)制起點(diǎn)ori以及抗生素的標(biāo)志基因，因此cosmid載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌以后，徹低可以像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中舉行繁殖。 (4) cosmid載

7、體往往比較小，能夠插入較大的外源基因片段。大多數(shù)cosmid載體的長度小于10kb，根據(jù)噬菌體的包裝能力，噬菌體的最大承載外源片段能力為：(105×48kb)-cosmid載體的長度。由此可以計(jì)算出cosmid載體可以克隆的外源片段長度為15145kb。因?yàn)閏osmid載體具有大片段克隆能力，所以cosmid載體往往用于基因組文庫的構(gòu)建，而噬菌體載體往往用于cdna文庫的構(gòu)建(圖8-3)。 圖8-3商業(yè)化的cosmid載體暗示圖 (三)噬菌粒載體 除了cosmid載體以外，在噬菌體和質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)之上進(jìn)展起來的另外一種載體就是噬菌粒(phagemid)載體。噬菌粒載體與cosmid載

8、體相比，它們存在許多共同之處。例如，在載體上它們都有抗生素基因、質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)等。但也有無數(shù)不同之處。 (1)噬菌粒載體的分子質(zhì)量更小，質(zhì)粒的大小通常在3kb左右。 (2)復(fù)制的方式有所不同。cosmid載體通過噬菌體的ter體系識別兩個cos位點(diǎn)將外源片段和載體包裝到噬菌體中。噬菌粒載體在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)根據(jù)質(zhì)粒的方式舉行復(fù)制。當(dāng)有輔助噬菌體存在的狀況下，噬菌粒的復(fù)制方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，根據(jù)滾環(huán)的方式舉行復(fù)制，并包裝成為噬菌體顆粒以后分泌出大腸桿菌的細(xì)胞。 (3)因?yàn)槭删］d體與質(zhì)粒載體非常相像，噬菌粒載體所攜帶的外源片段可以通過提取質(zhì)粒dna以后舉行挺直測序。相反，噬菌體載體或者cosmid載體上

9、所攜帶的外源片段必需經(jīng)過亞克隆以后才干舉行序列測定。 現(xiàn)在已經(jīng)構(gòu)建的噬菌粒載體有無數(shù)種類，最為常用的是stragene公司的pbluescript sk(+-)(圖8-4)。pbluescript sk(+-)具有噬菌粒載體的一些普遍特征：具有一個抗生素標(biāo)志基因，用于轉(zhuǎn)化子克隆的挑選標(biāo)志。 在多克隆位點(diǎn)上分離加入t3和t7啟動子，用于定向插入外源片段。同時在多克隆位點(diǎn)中具有m13引物用于外源片段或者基因的序列測定。分離插入有puc質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和fl質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。puc質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)能夠保證pbluescript在大腸桿菌中根據(jù)質(zhì)粒的復(fù)制方式舉行復(fù)制。在有利于噬菌體存在的狀況下，pblues

10、cript能夠識別fl質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)并分離合成(+-)單鏈dna分子。載體上的lacz基因可以保證能夠利用藍(lán)白斑篩選的辦法篩選pbluescript重組克隆。 圖8-4 pbluescript ii sk(+-)噬菌粒(phagemid)載體暗示圖 pbluescript載體主要用于cdna文庫的構(gòu)建和對插入的外源基因舉行表達(dá)分析。 (四)噬菌體載體及其衍生載體的用途 噬菌體載體的主要用途是構(gòu)建cdna文庫或者基因組文庫。其主要過程是：某種生物體的某個組織的cdna分子與噬菌體載體相銜接，然后通過體外包裝，挺直轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞。通過體外轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，1ug的cdna分子可以獲得106以上個噬菌斑。這些

11、不同的噬菌體中都攜帶了一條外源cdna分子。這個噬菌體cdna文庫就可用于基因的克隆。 利用cosmid載體構(gòu)建基因組文庫的基本過程如下所述。 (1)載體的制備。因?yàn)閐na上具有cos位點(diǎn)，不同dna分子之間能夠通過cos位點(diǎn)舉行互相銜接形成多個cos的聯(lián)體分子。噬菌體中具有一種識別兩個cos位點(diǎn)的酶切體系，該系統(tǒng)能夠識別具有一定長度的含兩個cos位點(diǎn)的dna分子，并通過末端酶將多聯(lián)體的分子根據(jù)兩個cos位點(diǎn)的區(qū)段切割成為一個dna單位。這種dna分子能夠在噬菌體的包裝作用下包裝到噬菌體中。 (2)基因組片段的酶切消化。通過瓊脂糖包埋的辦法獲得大片段基因組dna以后，將這些大片段基因組dna分

12、子舉行隨機(jī)切割以獲得較大片段的dna分子用于文庫的構(gòu)建。現(xiàn)在比較常用的辦法是利用限制性內(nèi)切核酸酶對基因組片段舉行部分消化，如alu、hae, mbo、sau3a等。根據(jù)這些具有4個堿基識別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶，平均每246個堿基就有一個酶切位點(diǎn)，利用這個特點(diǎn)就能夠?qū)︵駠骰蚪M舉行隨機(jī)切割。在實(shí)際的運(yùn)用中，較多選用sau3a作為限制性內(nèi)切對基因組舉行不徹低酶切。因?yàn)閟au3a酶切以后產(chǎn)生gatc的黏性末端，可以挺直插入到同尾酶bamh切割的載體中。 (3)片段的分級。經(jīng)過部分酶切以后的片段大小不一。因?yàn)閏osmid載體的包裝能力有最低、最高的限度，因此最好將所獲得的片段舉行分級處理。普通的辦法是將酶切以后的片段與蔗糖舉行密度梯度離心，經(jīng)過一個晚上的超速離心以后，dna片段根據(jù)一定大小與一定濃度的蔗糖成梯度分布在試管中。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的需要取出所需密度的蔗糖，然后舉行透析處理就可以得到一定長度的酶切基因組dna分子。 (4)基因組片段與載體的銜接。將目標(biāo)片段的基因組dna分子與載體片段銜接，獲得插入片段的載體分子。 (5)遺傳轉(zhuǎn)化。