生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1、實(shí)驗(yàn)日期：2017. 11. 1實(shí)驗(yàn)班級(jí)：生物技術(shù) 指導(dǎo)教師：張建麗姓名：高熹學(xué)號(hào)：1120152430測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，了解細(xì)菌生長(zhǎng)的特點(diǎn)，綜合訓(xùn)練微生物實(shí)驗(yàn)的基本實(shí)驗(yàn)技能。2 .鞏固培養(yǎng)基的配制、滅菌、儀器的包扎、倒平板。3 .掌握用比濁法測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)原理將少量細(xì)菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，一 定 時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的數(shù)量作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制的曲線叫生長(zhǎng)曲線。它反映了單細(xì)胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時(shí)所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)規(guī)律。依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延緩期、生

2、長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期。 將每一種一定量的細(xì)菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細(xì)胞要經(jīng)歷延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)階段。延遲期：又叫調(diào)整期。細(xì)菌接種至培養(yǎng)基后，對(duì)新環(huán)境有一個(gè)短暫適應(yīng)過(guò)程（不適應(yīng)者可因轉(zhuǎn)種而死亡）。此期曲線平坦穩(wěn)定，因?yàn)榧?xì)菌繁殖極少延遲期長(zhǎng)短因素種、接種菌 量、菌齡以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等不同而異，一般為1? 4小時(shí)。此期中細(xì)菌體積增大，代謝活躍，為細(xì)菌的分裂增殖合成、儲(chǔ)備充足的酶、能量及中間代謝產(chǎn) 物。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：又稱指數(shù)期。此期生長(zhǎng)曲線上活菌數(shù)直線上升。細(xì)菌以穩(wěn)定的幾何級(jí)數(shù)極快增長(zhǎng)，可持續(xù)幾小時(shí)至幾天不等（視培養(yǎng)條件及細(xì)菌代時(shí)而異）。此期細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性都很

3、典型，對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，因此研究細(xì)菌性狀以此期細(xì)菌最好?？股刈饔茫瑢?duì)該時(shí)期的細(xì)菌效果最佳。穩(wěn)定期：該期的生長(zhǎng)菌群總數(shù)處于平坦階段，但細(xì)菌群體活力變化較大細(xì)菌濃度達(dá)到最大即環(huán)境最大容納量。由于培 養(yǎng)基中 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物（有機(jī)酸、過(guò)氧化物等）積累 PH下降等不利因素的影響，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降，相對(duì)細(xì) 菌死亡數(shù)開(kāi)始逐漸增加，此期細(xì)菌增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡。細(xì)菌形態(tài)、染色、生物活性可出現(xiàn)改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物如外毒素、內(nèi)毒素、抗生素、以及芽抱等。衰亡期：隨著穩(wěn)定期發(fā)展，細(xì)菌繁殖越來(lái)越慢，死亡菌數(shù)明顯增多。活菌數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間呈反比關(guān)系，此期細(xì)菌變長(zhǎng)腫脹或畸形衰變，甚至菌體自溶，難以

4、辯 認(rèn)其形。生理代謝 活 動(dòng)趨于停滯。故陳舊培養(yǎng)物上難以鑒別細(xì)菌。體內(nèi)及自然界細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖受機(jī)體免疫因素和環(huán)境因素的多方面影響，不會(huì)出現(xiàn)象培養(yǎng)基中那樣典型的生長(zhǎng)曲線。掌握細(xì)菌生長(zhǎng)規(guī)律，可有目的地研究控制病原菌的生長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn) 和培養(yǎng)對(duì)人類有用的細(xì)菌。 這4個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所不同。因此通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，可了解個(gè)菌的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。測(cè)定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實(shí)驗(yàn)室條件選用。本實(shí)驗(yàn)用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（0D值）成正比，因此可利用 分光光度 計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)的

5、0D值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線，此法快捷、簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料準(zhǔn)備好的大腸桿菌和枯草桿菌菌液、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、比色皿、恒溫?fù)u床、培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、酒精燈、電爐、接種環(huán)、試管架、錐形瓶、無(wú)菌吸管、燒杯、乳膠頭、報(bào)紙、膠塞、玻璃棒等。四.實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)步驟：配制營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 7營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基滅菌7配制大腸桿菌菌液 標(biāo)記f接種f培 養(yǎng)f測(cè)定f繪制生長(zhǎng)曲線1.配制營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：以1000ml記，牛肉膏：3? 0g、蛋白B: 10, 0g NaCI:5. 0g. 水：1000ml pH:7. 4-7. 62,營(yíng)養(yǎng)肉湯培

6、養(yǎng)基滅菌：將步驟一包好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋121 C滅菌15mi n.3,接種：用ImL無(wú)菌移液管分別移取ImL大腸桿菌菌液和lml的枯草桿菌菌液至錐形瓶 中，并充分震蕩均勻.4,培養(yǎng)：將錐形瓶置于37 C下在恒溫?fù)u床上培養(yǎng) （150r/min ）。然后分別按對(duì)應(yīng) 時(shí) 間將 錐形瓶取出，待培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測(cè)定 0D值。5 .測(cè)定：將培養(yǎng)的大腸菌群菌液用無(wú)菌移液管移取到比色皿中，選用 600nm分光 光度計(jì) 上調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用蒸憾水作為空白對(duì)照，并對(duì)不同時(shí)間培養(yǎng)液從 0起依次進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濃度 大 的菌懸液用自來(lái)水適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其 ODfi大約在0. 2-0. 8之間，經(jīng)稀釋后測(cè)得 的0D 值要乘

7、于稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實(shí)際的 0D值。6 .繪制生長(zhǎng)曲線：對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。五,實(shí)驗(yàn)結(jié)果大腸桿菌:時(shí)間/mi n0150250310340370400430460490520550Od（倍數(shù) 奐算）0.6380.8671.566O cmG2. 3003. 1003, 5323, 7084,0084.4645,0645,229枯草桿菌：時(shí)間/mi n0150250310340370400430460490520550Od（倍 數(shù)換 算）0. 5610. 3990. 3530.2990. 3290.5580. 7740.9421.2641.6141. 7582.214六.

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析繪制大腸桿菌生長(zhǎng)曲線65310 4.4644 4Q08290.8672.3-2OSS,.56h100200300400500000繪制枯草桿菌生長(zhǎng)曲線2.52 ，0 -1i 1 ii 1 i01002003004005006001 .隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基里的液體變得越來(lái)越混濁，所散發(fā)出來(lái)的味道也越來(lái)越濃，大腸桿菌培養(yǎng)瓶味道很難聞，是因?yàn)榇竽c桿菌增長(zhǎng)迅速，后來(lái)數(shù)量達(dá)到頂峰，此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)己被消耗殆盡，大腸桿菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)，有些大腸桿菌 死亡，最后數(shù)量不斷減少，直至變?yōu)镺o:剛開(kāi)始時(shí)細(xì)菌2 .通過(guò)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，了解了細(xì)菌生長(zhǎng)的特點(diǎn)，是緩慢增長(zhǎng)，后來(lái)增長(zhǎng)

9、迅速，呈“ J”型，最后細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，一段數(shù)量達(dá)到頂峰，在 時(shí)間內(nèi)保 持不變3 .由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，兩個(gè)菌培養(yǎng)菌在對(duì)數(shù)期，未到衰亡期，短，考慮到測(cè)量的時(shí)間太10個(gè)小時(shí)左右，因此，未到衰亡期。繪制大腸桿菌和枯 （標(biāo)出生長(zhǎng)曲線中七.思考題1 .草桿菌在兩種接種方法下的生長(zhǎng)曲線 四個(gè)時(shí)期的位置和名稱）答：繪制出了生長(zhǎng)曲線，只觀察到了平緩期和對(duì)數(shù)期，大腸桿菌觀察到即將開(kāi)始平穩(wěn)期。2 .為什么用比濁法測(cè)定的細(xì)菌生長(zhǎng)只是表示細(xì)菌的相對(duì)生長(zhǎng)狀況？答：因?yàn)楸壬ㄖ荒芘袛嗑南鄬?duì)密度，而沒(méi)有辦法區(qū)分活菌和死菌，因此只能表示細(xì)菌 的相對(duì)生長(zhǎng)狀況。3 .生長(zhǎng)曲線中為什么會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定期和衰退期？在生產(chǎn)實(shí)踐中怎樣縮短延遲期

10、？怎樣延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期？怎樣控制衰退期？答：培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)有限，在菌的數(shù)量達(dá)到環(huán)境允許最大值時(shí)，同種菌之間競(jìng)爭(zhēng)劇烈，故出現(xiàn)穩(wěn)定期，隨著營(yíng)養(yǎng)的進(jìn)一步消耗，菌沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)，出 現(xiàn)死亡，所 以出現(xiàn)了衰退期?？s短延遲期，可以采用營(yíng)養(yǎng)成分與原來(lái)相近的培養(yǎng)基，或 者 米 用該種菌原來(lái)類似的生長(zhǎng)條件與營(yíng)養(yǎng)。延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，恒化器可以將微生物保持在對(duì)數(shù)期進(jìn)行研究，恒濁器可以使細(xì)菌連續(xù)生長(zhǎng)。控制衰退期可以及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，分離出死菌。 4.接種時(shí)種子在什么條件下為宜，液體種子比斜面種子為什么優(yōu)越？ 答：左手持皿用拇指、食指和中指將皿蓋揭開(kāi)約20-30度左右，角度越小遭空氣污染的可能性越小，并靠近酒精燈附近操作。右手持接種環(huán)，先在酒精燈滅菌，然后取菌液，將沾菌接種環(huán)在培養(yǎng)基的邊緣劃原始線，而后使