精確的機(jī)械感應(yīng)裝置在基底硬度對(duì)細(xì)胞牽引力影響的研究(翻譯)

1、精確的機(jī)械感應(yīng)裝置在基底硬度對(duì)細(xì)胞牽引力影響的研究Léa Trichet, Jimmy Le Digabel, Rhoda J. Hawkins, Sri Ram Krishna Vedula, Mukund Gupta, Claire Ribrault,Pascal Hersen, Raphaël Voituriez, and Benoît Ladoux細(xì)胞遷移在許多基本的生物學(xué)的研究中，如細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、腫瘤轉(zhuǎn)移和傷口愈合等，都有很重要的作用。細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)與基底產(chǎn)生的牽引力與基底硬度有直接的關(guān)系。最常用的理論是，細(xì)胞主要在力傳導(dǎo)的地方對(duì)基底產(chǎn)生牽引力，稱(chēng)為粘著斑

2、，它的大小至少在初始階段和細(xì)胞基底有一定的關(guān)系。事實(shí)上，我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直接表明了在硬度大的基底上會(huì)更快的產(chǎn)生牽引力，基底硬度決定了粘著斑上力的測(cè)量結(jié)果。在基于主動(dòng)凝膠理論的唯象模型的基礎(chǔ)上，從精確的機(jī)械感應(yīng)機(jī)制得出對(duì)基底硬度感應(yīng)的是細(xì)胞的骨架而不是細(xì)胞本身。精確的機(jī)械感應(yīng)，可以得出在硬度梯度上細(xì)胞自適應(yīng)的遷移。在又硬度梯度的交界線(xiàn)上，我們實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到細(xì)胞不僅優(yōu)先遷移到較硬的基底上，而且在窄幅的硬度變化上更明顯。綜上，這些發(fā)現(xiàn)為我們提供了獨(dú)特的見(jiàn)解來(lái)研究細(xì)胞對(duì)外界刺激的影響和以細(xì)胞骨架為基礎(chǔ)的硬度感應(yīng)機(jī)制。關(guān)鍵詞：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，微制造，生物力學(xué)，細(xì)胞力學(xué)細(xì)胞遷移不僅與細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)有

3、關(guān)，還有其機(jī)械性能，細(xì)胞通過(guò)拉動(dòng)基底直接感應(yīng)基底的物理特性及其環(huán)境。大量資料表明彈性陣列在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能有關(guān)鍵性的作用，例如影響細(xì)胞粘附性、遷移和分化。這是通過(guò)細(xì)胞與基底產(chǎn)生肌動(dòng)球蛋白的力量來(lái)感應(yīng)基底硬度。細(xì)胞粘附的機(jī)械敏感性質(zhì)決定了細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）影響機(jī)械性能的靈敏度。通過(guò)粘著斑（FAs）的測(cè)量來(lái)測(cè)量受到的牽引力。文獻(xiàn)中報(bào)道，F(xiàn)As的面積和它的動(dòng)力有一定的相關(guān)性。機(jī)械敏感性是通過(guò)受力后來(lái)誘發(fā)FAs的觸發(fā)，研究其中的關(guān)系，也可以反過(guò)來(lái)分析。但是對(duì)于細(xì)胞的機(jī)械敏感性如何感應(yīng)它的基底硬度換（還）不清楚。在許多研究中也出現(xiàn)了很多相互矛盾的結(jié)論。此外，最經(jīng)典的模型建立和間接觀(guān)測(cè)，表明可以用該收縮肌動(dòng)

4、球蛋白裝置可以作為一個(gè)基底硬度傳感器。但是從物理的角度來(lái)看，周?chē)幕|(zhì)對(duì)響應(yīng)細(xì)胞收縮的變形了解甚少。細(xì)胞機(jī)械敏感性的合理機(jī)制，以為著可以通過(guò)有細(xì)胞外基質(zhì)施加應(yīng)力或應(yīng)變。力的傳導(dǎo)的影響機(jī)制也許可以解釋細(xì)胞在不同基底硬度對(duì)細(xì)胞粘著、遷移和分化的差異。結(jié)果與討論在不同的基底硬度下，粘著斑和牽引力測(cè)量的動(dòng)態(tài)變化。我們通過(guò)函數(shù)關(guān)系，明確的得出這種基底粘著斑核形成和其硬度的關(guān)系。本文使用的儀器室是微作用力傳感器陣列（FSA）和REF52成纖維細(xì)胞的熒光顯微鏡表達(dá)熒光標(biāo)記的FA蛋白（YFP-樁蛋白）（圖1 A和B）。接種REF52細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)YFP-樁蛋白在FSA包括各種直徑和高度的纖連蛋白涂覆的微柱。這些

5、不同形狀的支微微柱導(dǎo)致基底有不同的彈簧常數(shù)系數(shù)（K從3到80，圖1 C），而不改變其分子表面尺度特性。當(dāng)細(xì)胞在基底上貼壁生長(zhǎng)5h后，細(xì)胞產(chǎn)生的牽引對(duì)微柱造成偏轉(zhuǎn)（圖1 B）。本文同時(shí)分析了牽引力和FAs塊隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化。作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，我們比較了細(xì)胞在平坦的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的實(shí)驗(yàn)（圖S1）。正如從以前的研究預(yù)期的那樣，這些分布是偏向?yàn)榛囊捕容^大的值。 直徑2微米的微柱基底FA的大小沒(méi)有影響，所以在FAS和平板PDMS基板（圖S1）的分布相似。圖1通過(guò)表達(dá)YFP-樁蛋白在微柱基底R(shí)EF52成纖維細(xì)胞的附著力和牽引力。（一）微柱基底的典型REF52細(xì)胞掃描電子顯微照片（比例尺，1

6、5）（B）單細(xì)胞在微柱基底的變形（K為34）。 微柱陣列（紅色）用Cy3纖維蛋白標(biāo)記，YFP-樁蛋白是綠色。 （比例尺，15（C）連續(xù)的記錄B圖中 FASDE 生長(zhǎng)和微柱位移變化圖像。（比例尺，10微米）（D）顯示FA上的PDMS微柱的頂部形成示意圖 。（E）力（藍(lán)色）以時(shí)間為橫軸（在基板K為 34）的函數(shù)。分析得出在細(xì)胞邊緣的分析的牽引力和FA是最大的。在大多數(shù)情況下，牽引力和FA隨著時(shí)間的推移有緊密的聯(lián)系（圖1D和E）：力和FA都隨著時(shí)間相同的增加（如基底K為34的一個(gè)基板上的例子，圖1E）。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)硬度梯度（480）來(lái)驗(yàn)證硬度對(duì)FAs的影響。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，我們?cè)诓煌?xì)胞的FAde

7、 FA的 邊緣取平均力F（N5）。平均牽引力（Fk），在樁蛋白位點(diǎn)事施加，增長(zhǎng)更迅速，具有較高的硬度（圖2A）的硬度達(dá)到了較高的飽和度。和牽引力相比，F(xiàn)A面積的增長(zhǎng)就不太明顯（圖2B）。此外，由圖2C可知，在硬度范圍內(nèi)，飽和壓力Fp 正比于基底剛度。這一結(jié)果表明，飽和力對(duì)應(yīng)大約0.840.03微米的基板變形恒定，與之前的其它類(lèi)型細(xì)胞研究一致。有趣的是，力隨時(shí)間增加的初始速率，dF/dt，還與基板的硬度呈線(xiàn)性變化，使微柱位移等于1.3 nm / s時(shí)與硬度無(wú)關(guān)?？傊@些數(shù)據(jù)表明的，是由基底的變形調(diào)節(jié)來(lái)驗(yàn)證機(jī)械敏感機(jī)制的存在。圖2，牽引力和粘著動(dòng)態(tài)曲線(xiàn)。（A）平均牽引力與時(shí)間在不同基底硬度的函數(shù)

8、。細(xì)胞數(shù)目N5和支柱數(shù)目N15。每條曲線(xiàn)前面呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)，最后力達(dá)到最大。（B）FA面積與時(shí)間在不同基底硬度的函數(shù)。（C）飽和力金和基底硬度的函數(shù)。（D）牽引力的的變化率和基底硬度的曲線(xiàn)圖粘著斑面積，牽引力，和壓力之間的關(guān)系。為了進(jìn)一步了解牽引力的性質(zhì)，我們研究作為橫軸的基底硬度的函數(shù)的力和粘著區(qū)面積之間的關(guān)系。研究牽引力和FA面積在不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)系，繪圖3A，對(duì)于基底硬度從4至80（每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)平均值大致等于至少15的FA區(qū)域）。這個(gè)剛度范圍從不同的微柱基底對(duì)應(yīng)于一個(gè)等效的楊氏模量（2.8至60kPa）。在給定的基底硬度上牽引力和FA區(qū)域之間得到一個(gè)線(xiàn)性關(guān)系。但是對(duì)于不同的基底硬度有事結(jié)

9、果就不同。用不同力值可以得到同樣的FA面積。例如，從3變化到42 剛度范圍和從4.7到80（圖3A）內(nèi)的力，獲得了相同的面積。事實(shí)的FA相似的區(qū)域可以對(duì)應(yīng)不同的牽引力，如圖 3 C和D，與文獻(xiàn)的結(jié)果吻合。 其中被發(fā)現(xiàn)一個(gè)變異的FA在不同的位置之間的應(yīng)力，但僅用于一個(gè)給定基底硬度。這些結(jié)果與FA 機(jī)械敏感性機(jī)制整體對(duì)比，假定一個(gè)恒定應(yīng)力是通常普遍接受的理解。有趣的是，這個(gè)零線(xiàn)性關(guān)系引起了非零的牽引力。這種觀(guān)察可以通過(guò)另一種機(jī)制來(lái)解釋FA的張力比0.3小 。這個(gè)是殘留面積0.3焦配合物的典型尺寸 類(lèi)似，這就能夠承受較大的牽引力而不與附加其他力。圖 3，牽引力和粘著區(qū)域之間的關(guān)系。 （A）FA面積在

10、各時(shí)間點(diǎn)的平均力在不同剛度的圖像。 （B）這個(gè)剛度范圍從不同的微柱基底對(duì)應(yīng)于一個(gè)等效的楊氏模量，2.8至60kPa。在34之下快速增加硬度，隨后通過(guò)緩慢增加到80。（C和D）一個(gè)REF52細(xì)胞從軟基板（12）上和較硬的基板（54）上生長(zhǎng)的典型例子。 微柱是紅色、樁蛋白綠色。FAs的大?。ū壤?，8微米）。（力比例尺，10 nN）。然后，定義應(yīng)力（）為力除以FAs面積。應(yīng)力對(duì)應(yīng)于不同的曲線(xiàn)，代表有不同的力和FAs面積的關(guān)系對(duì)應(yīng)，如圖3A。通過(guò)繪制應(yīng)力和硬度的函數(shù) （圖 3B），我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)力并不是保持不變，而是硬度的遞增函數(shù)。這種關(guān)系與佩勒姆和王 的研究結(jié)果吻合。更確切地說(shuō)，我們可以把壓力提高7

11、(1=1kPa)在硬度在34以下時(shí),通過(guò)在更高硬度的飽和段進(jìn)行調(diào)節(jié)。在以往的研究中,Balabanet得出結(jié)論認(rèn)為細(xì)胞粘附的機(jī)械調(diào)節(jié)受恒定的壓力，但他們僅在一個(gè)單一的剛度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們的確發(fā)現(xiàn)他們的研究結(jié)果（圖 3B）中使用的基底硬度的應(yīng)力和硬度關(guān)系有一定的關(guān)聯(lián)。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明不是因?yàn)橄惹皥?bào)道機(jī)械敏感機(jī)制的影響不是 FAs的影響，但需要精確的機(jī)制來(lái)研究。精確機(jī)械敏感機(jī)制建模仿真分析。應(yīng)用于牽引力和FA的形成在分子尺度形成引起的彈性變形它的一些組成蛋白質(zhì)的組織變革，這反過(guò)來(lái)又可以提高新的蛋白質(zhì)具有約束力的生長(zhǎng)觸點(diǎn)。這樣的機(jī)制，依賴(lài)于粘接劑的局部剛度和基底亞微米尺度，其對(duì)應(yīng)本文中，將PD

12、MS的彈性的表面，也就是說(shuō)，它的楊氏模量（），其特征在于微柱的頂部（在我們的唯象模型的SI Text中有詳細(xì)介紹）。因此，如果機(jī)械反饋是由FA本身決定的，然后由FAs施加的壓力將取決于而不是k。然而，我們?cè)谶@里計(jì)算的應(yīng)力，取決于在微柱的彈簧常數(shù)系數(shù)（對(duì)于相同）。這樣依賴(lài)關(guān)系表明，必須反饋參與涉及的結(jié)構(gòu)和其他額外的FAs。我們建議這一反饋機(jī)制是精度更大范圍的細(xì)胞骨架，特別是FA上纖維應(yīng)力。我們現(xiàn)在討論一個(gè)骨架的變形，通過(guò)細(xì)胞骨架作用對(duì)應(yīng)力產(chǎn)生活性影響。通常，這種機(jī)械活化框架內(nèi)可以理論分析粘彈性凝膠活性。這個(gè)唯象理論得出平衡理論，如細(xì)胞骨架，存在活性應(yīng)力（肌動(dòng)蛋白/肌球蛋白收縮）和向列順序參數(shù)的肌

13、動(dòng)蛋白絲的局部方向成正比。從到耦合，這是在列相的凝膠標(biāo)準(zhǔn)，則意味著該應(yīng)力耦合取決于和應(yīng)。變換句話(huà)說(shuō)，變形x 包括一個(gè)應(yīng)力和，因此重組纖絲，這反過(guò)來(lái)又產(chǎn)生了主動(dòng)的壓力。對(duì)于這種對(duì)到應(yīng)力耦合，該的松弛時(shí)間是很長(zhǎng)，這意味著彈性細(xì)胞骨架流體變形學(xué)一樣。事實(shí)上，細(xì)胞骨架的流變學(xué)是已經(jīng)觀(guān)察到非常復(fù)雜，但是僅響應(yīng)到一個(gè)瞬時(shí)拉伸。我們有理由假設(shè)本文的情況是一個(gè)持續(xù)的約束，其中已經(jīng)報(bào)道應(yīng)變硬化和長(zhǎng)期松弛時(shí)間?；子捕葘?duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向性的影響。通過(guò)細(xì)胞骨架的極化驅(qū)動(dòng)這樣一個(gè)大規(guī)模的機(jī)制，也可以提供細(xì)胞遷移一個(gè)合理的解釋。我們觀(guān)察到，在更快的牽引力的增長(zhǎng)和在硬度更大的基材有更高的飽和力值，并增加壓力相對(duì)于基板的剛度

14、，使我們自然地有以下預(yù)測(cè)：極化的細(xì)胞從一個(gè)更軟的基體來(lái)會(huì)突然產(chǎn)生大的牽引力，因?yàn)樗麄兘佑|到堅(jiān)硬的一面，而旋轉(zhuǎn)到垂直遷移到硬基質(zhì)。另一方面，細(xì)胞從僵硬側(cè)來(lái)將保持的邊界。這些預(yù)測(cè)為指導(dǎo)的遷移的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。從軟到硬，反之亦然在同一創(chuàng)建移動(dòng)微柱基底。這種基底組成的直徑為1和2的微柱連續(xù)陣列，使得剛度比大約為10（KS / KS10），而微柱表面密度保持不變（圖5A）。細(xì)胞從柔軟的部分，或從僵硬的一部分來(lái)進(jìn)行分別考慮考慮。如該圖所示， 圖5D設(shè)計(jì)基底硬度從3到34，細(xì)胞確實(shí)在向的硬度部分對(duì)準(zhǔn)垂直于邊界移動(dòng)。接下來(lái)，使用上述測(cè)定法來(lái)分析不同剛度的微柱底單個(gè)細(xì)胞的遷移路徑。通過(guò)計(jì)數(shù)細(xì)胞的擇優(yōu)取向后，他們碰到的

15、邊界對(duì)這兩個(gè)不同的部分襯底的進(jìn)行了硬度趨向進(jìn)行了分析。我們測(cè)量的數(shù)對(duì)應(yīng)的是細(xì)胞從軟基板到來(lái)，到達(dá)邊界（）。通過(guò)改變軟微柱從3134的硬度，我們得到最佳遷移效率大約硬度值為3-10大約有70的細(xì)胞走向更硬的一側(cè)（圖5B）。叉k，沒(méi)有觀(guān)察到到優(yōu)先方向（只有35-50的細(xì)胞遷移朝著更嚴(yán)厲的基板）。與此相反，大多數(shù)細(xì)胞位于較硬方向沒(méi)有檢驗(yàn)遷移到堅(jiān)硬的微柱（直方圖，圖5C）。另外，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞是否真正反應(yīng)以在基板的剛性和不粘附的幾何形狀，我們制作粘合面與上涂有熒光標(biāo)記的纖連蛋白（圖S2）的玻璃蓋玻片上相同的幾何形狀，為了限制細(xì)胞粘附到在基片轉(zhuǎn)印圖案，然后用處理過(guò)的聚乙二醇以鈍化表面的其余部分呈現(xiàn)

16、不沾。在這些條件下，我們得到的數(shù)組的纖連蛋白斑塊印刷到玻璃具有相同的粘合劑表面和尺寸為支柱的頂部。在這樣的表面呈現(xiàn)相同的幾何形狀，但沒(méi)有剛性依賴(lài)，我們觀(guān)察到的幾何不能解釋我們對(duì)以前的結(jié)果支柱基板。事實(shí)上，只有37的細(xì)胞從1到2遷移到那些區(qū)域，并在53的區(qū)域當(dāng)?shù)谝淮畏胖迷诿娣e為2方向相反。當(dāng)基片的兩側(cè)提出了一個(gè)剛度較大圍繞50，我們觀(guān)察到細(xì)胞的遷移朝更硬的部分減少了，仿佛細(xì)胞不能感覺(jué)到任何兩側(cè)（圖5B）之間的差異。換句話(huà)說(shuō)，最佳的應(yīng)于在應(yīng)力在基體剛性的臺(tái)階差內(nèi)出現(xiàn)窄幅變化。這些結(jié)果可能與該細(xì)胞以適應(yīng)他們自己的剛度。此外，朝更嚴(yán)厲的端遷移呈正相關(guān)到的應(yīng)力剛度關(guān)系的初始制度（即應(yīng)力增加達(dá)到飽和之前，

17、見(jiàn)圖 3B）。通過(guò)分析微柱于變形遷移活動(dòng)在柔軟和堅(jiān)硬的基板之間（圖5）邊界活動(dòng)，我們發(fā)現(xiàn)，作為一個(gè)單元從柔軟的部分來(lái)被探測(cè)的接口，力迅速上升到30nN（圖5F），導(dǎo)致向硬的區(qū)域遷移胞體（圖5E）。在與我們之前的結(jié)果一致，這種行為可以歸因于細(xì)胞沿該軸極化，而遷移從軟到硬?？磥?lái)，當(dāng)剛度的步驟相對(duì)應(yīng)的大量增加朝著更硬的部分遷移能力增強(qiáng)。根據(jù)圖3B，硬度從1和50之間的范圍變化對(duì)應(yīng)于細(xì)胞基底硬度感應(yīng)。然而，如果基板的兩側(cè)對(duì)應(yīng)于類(lèi)似應(yīng)力的貼壁細(xì)胞產(chǎn)生的值，無(wú)論什么剛性，細(xì)胞從一個(gè)側(cè)面不遷移。當(dāng)細(xì)胞感知僵硬的一面，細(xì)胞發(fā)揮更大的力從而可能誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的極化和細(xì)胞骨架硬的一面遷移。在這里得出，這種限制可以通

18、過(guò)的相對(duì)變化來(lái)確定細(xì)胞雙方發(fā)揮應(yīng)激反應(yīng)。圖5細(xì)胞微柱基底上的遷移。 （一）掃描電子顯微照片顯示微柱表面表現(xiàn)出不同剛度的細(xì)胞擴(kuò)散圖。微柱的直徑為1（頂部區(qū)域）和2（底部區(qū)域）。細(xì)胞從基底柔軟朝硬的方向遷移（比例尺，10微米）（B）基底的彈簧系數(shù)從3 到134，細(xì)胞從軟基底到硬基底的遷移圖，紅色的表示在硬基底的細(xì)胞數(shù)目，藍(lán)色為在軟基底上。（C）基底的彈簧系數(shù)從34 到14000，細(xì)胞從硬基底到軟基底的遷移圖，紅色的表示在硬基底的細(xì)胞數(shù)目，藍(lán)色為在軟基底上。說(shuō)明細(xì)胞更喜歡硬基底（D）REF52細(xì)胞的在硬（34）和軟（3）基板之間的運(yùn)動(dòng)明視場(chǎng)圖像。虛線(xiàn)表示邊界。（比例尺，20微米）（E）REF52細(xì)胞從軟到硬基質(zhì)動(dòng)力分配。 微柱紅色，細(xì)胞藍(lán)色 （比例尺，5m）細(xì)胞柔軟和堅(jiān)硬的基板（1微柱與2微柱）之間的邊界呈現(xiàn)在柔軟的部分勢(shì)力的大致均勻分