酶工程第四章

1、第四章第四章 固定化酶與固定化細(xì)胞固定化酶與固定化細(xì)胞v第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v第二節(jié)第二節(jié) 固定化方法固定化方法v第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶性質(zhì)固定化酶性質(zhì)v第四節(jié)第四節(jié) 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)v第五節(jié)第五節(jié) 固定化酶的應(yīng)用固定化酶的應(yīng)用一一 游離酶在應(yīng)用中所存在的問(wèn)題游離酶在應(yīng)用中所存在的問(wèn)題1 酶在水溶液中參與反應(yīng)，難以回收酶，導(dǎo)致酶在水溶液中參與反應(yīng)，難以回收酶，導(dǎo)致應(yīng)用生產(chǎn)成本高，而且應(yīng)用過(guò)程難于連續(xù)化；應(yīng)用生產(chǎn)成本高，而且應(yīng)用過(guò)程難于連續(xù)化；此外酶蛋白殘留給產(chǎn)物的分離純化帶來(lái)困難。此外酶蛋白殘留給產(chǎn)物的分離純化帶來(lái)困難。2 酶的穩(wěn)定性一般較差，易受環(huán)境影響（物理酶的穩(wěn)定性

2、一般較差，易受環(huán)境影響（物理因素、化學(xué)因素、生物因素），活力下降甚至因素、化學(xué)因素、生物因素），活力下降甚至失活。失活。 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述v二固定化酶概況二固定化酶概況 定義定義:凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)地使用凡限制在一定的空間范圍內(nèi)并能連續(xù)反復(fù)地使用的酶。的酶。 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：1916年年Nelson和和Griffin，骨粉吸附轉(zhuǎn)化酶，骨粉吸附轉(zhuǎn)化酶 研究：研究：1953年，年，Grubhofer和和Schloith，重氮化樹(shù)酯，羧，重氮化樹(shù)酯，羧肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶 工業(yè)化工業(yè)化：1969年千鈿一郎，固定氨基酰化酶，年千鈿一郎，固定

3、氨基?；?，D,L-氨氨基酸基酸 不溶于水不溶于水水不溶性酶，固相酶和固著酶水不溶性酶，固相酶和固著酶 1971年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議，年，第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議，“固定化酶固定化酶”名稱名稱三三 固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn)重復(fù)使用重復(fù)使用 載體昂貴載體昂貴產(chǎn)物易于分離產(chǎn)物易于分離 特性會(huì)發(fā)生改變特性會(huì)發(fā)生改變穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高 部分酶活力喪失部分酶活力喪失連續(xù)加工連續(xù)加工 輔因子再生及多酶輔因子再生及多酶 反應(yīng)存在問(wèn)題反應(yīng)存在問(wèn)題v四四 固定化菌體固定化菌體 用一定的方法對(duì)菌體或菌體碎片進(jìn)行固定，直接用一定的方法對(duì)菌體或菌體碎片進(jìn)行固定，直接應(yīng)用菌體或菌體碎片中的酶

4、或酶系進(jìn)行催化反應(yīng)。應(yīng)用菌體或菌體碎片中的酶或酶系進(jìn)行催化反應(yīng)。 五五 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞 定義：凡限制在一定的空間范圍內(nèi)，并能連續(xù)定義：凡限制在一定的空間范圍內(nèi)，并能連續(xù)反復(fù)地使用的能進(jìn)行生命活動(dòng)細(xì)胞。反復(fù)地使用的能進(jìn)行生命活動(dòng)細(xì)胞。五五 固定化菌體或細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)固定化菌體或細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn)省去酶分離過(guò)程省去酶分離過(guò)程 細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)輔因子再生及多酶反應(yīng)輔因子再生及多酶反應(yīng) 所需酶的分解所需酶的分解穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高 副產(chǎn)物副產(chǎn)物 細(xì)胞壁和膜阻礙底物細(xì)胞壁和膜阻礙底物 111111111111111和產(chǎn)物的滲透、擴(kuò)散和產(chǎn)物的滲透、擴(kuò)散 1973年，日本在工業(yè)上

5、成功固定化大腸年，日本在工業(yè)上成功固定化大腸桿菌菌體，利用菌體中的天門冬氨酸酶，桿菌菌體，利用菌體中的天門冬氨酸酶，連續(xù)催化反丁烯二酸為連續(xù)催化反丁烯二酸為L(zhǎng)-天門冬氨酸。天門冬氨酸。第二節(jié)第二節(jié) 固定化方法固定化方法一固定化方法：一固定化方法：吸附法，吸附法，共價(jià)結(jié)合法，共價(jià)結(jié)合法，交聯(lián)法，交聯(lián)法，包埋法包埋法v二二 載體類型載體類型v1 來(lái)自于自然的有機(jī)載體來(lái)自于自然的有機(jī)載體v 優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì):與酶有很好的相容性與酶有很好的相容性v 多糖類物質(zhì)及其衍生物多糖類物質(zhì)及其衍生物(多孔多孔,親水親水)v 纖維素及其衍生物纖維素及其衍生物(DEAE,CM)v 葡聚糖葡聚糖(Dextran)v 瓊脂糖瓊

6、脂糖(agarose)v 淀粉淀粉(starch)v 殼聚糖殼聚糖(chitosan)v 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(明膠明膠gelatin ) v 2 無(wú)機(jī)載體無(wú)機(jī)載體v 優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì):高壓穩(wěn)定性高壓穩(wěn)定性v 硅載體硅載體:多孔玻璃多孔玻璃;硅土硅土v 礦物原料礦物原料:粘土粘土,斑脫土斑脫土(火山火山灰分解成的一種粘土灰分解成的一種粘土)v3 無(wú)機(jī)合成載體無(wú)機(jī)合成載體v優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì):化學(xué)及機(jī)械穩(wěn)定性高化學(xué)及機(jī)械穩(wěn)定性高v離子交換樹(shù)脂離子交換樹(shù)脂v 功能基團(tuán)的共聚物功能基團(tuán)的共聚物v三三 固定化方法固定化方法v1 吸附法吸附法:通過(guò)弱的相互作用吸附到硅土通過(guò)弱的相互作用吸附到硅土,粘土粘土,離離子交換樹(shù)脂表面子交

7、換樹(shù)脂表面,如離子鍵如離子鍵,氫鍵氫鍵,疏水作用力及靜疏水作用力及靜電等電等.1）物理吸附）物理吸附 定義：使用對(duì)蛋白質(zhì)具有高度吸附能力的硅膠、定義：使用對(duì)蛋白質(zhì)具有高度吸附能力的硅膠、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纖維素等吸附劑，活性炭、多孔玻璃、石英砂和纖維素等吸附劑，將酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。將酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。 優(yōu)點(diǎn)：價(jià)廉，易操作易再生優(yōu)點(diǎn)：價(jià)廉，易操作易再生 缺點(diǎn)：易泄漏，易受污染缺點(diǎn)：易泄漏，易受污染 靜止法靜止法 反應(yīng)器上直接吸附法反應(yīng)器上直接吸附法 混合浴或振蕩浴吸附法混合浴或振蕩浴吸附法 例：高嶺士吸附胰凝乳蛋白酶例：高嶺士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附過(guò)氧

8、化氫皂土吸附過(guò)氧化氫酶酶, 淀粉酶淀粉酶; 纖維素粉吸附糖苷水解酶纖維素粉吸附糖苷水解酶; 火棉膠吸附木瓜蛋白酶，堿性磷酸酶，酯酶，葡萄火棉膠吸附木瓜蛋白酶，堿性磷酸酶，酯酶，葡萄糖糖-6-磷酸脫氫酶。磷酸脫氫酶。v2）離子吸附）離子吸附 定義：酶蛋白在解離狀態(tài)下因靜電引力而固著定義：酶蛋白在解離狀態(tài)下因靜電引力而固著于帶有與酶蛋白電荷相反的離子交換劑上的固定于帶有與酶蛋白電荷相反的離子交換劑上的固定化方法。化方法。 主要缺點(diǎn)：離子強(qiáng)度增加或者介質(zhì)主要缺點(diǎn)：離子強(qiáng)度增加或者介質(zhì)pH， 溫度改溫度改變時(shí)，離子吸附不穩(wěn)定，酶與載體解離。變時(shí)，離子吸附不穩(wěn)定，酶與載體解離。v 3）疏水吸附）疏水吸附

9、 N烷基（疏水）瓊脂糖烷基（疏水）瓊脂糖 黃嘌呤氧化酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酯酶、脲酶（疏水黃嘌呤氧化酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酯酶、脲酶（疏水性強(qiáng)）。性強(qiáng)）。v 4）親和吸附）親和吸附 伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A （利用此蛋白與糖蛋白的專一性結(jié)合）（利用此蛋白與糖蛋白的專一性結(jié)合）瓊脂糖吸附糖蛋白。瓊脂糖吸附糖蛋白。 5）螯合吸附）螯合吸附 利用酶蛋白上的金屬離子與載體基團(tuán)的螯合吸附。利用酶蛋白上的金屬離子與載體基團(tuán)的螯合吸附。v2 包埋法包埋法v1）定義：將酶包裹于凝膠格子或聚合物半透）定義：將酶包裹于凝膠格子或聚合物半透膜微膠囊中的方法。膜微膠囊中的方法。 該方法不需要化學(xué)修飾，反應(yīng)條件溫

10、和，適合該方法不需要化學(xué)修飾，反應(yīng)條件溫和，適合大多數(shù)酶，粗酶制劑，甚至完整的微生物細(xì)胞。大多數(shù)酶，粗酶制劑，甚至完整的微生物細(xì)胞。v2）根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為格子）根據(jù)載體材料和方法的不同，可分為格子型包埋法和微膠囊法。型包埋法和微膠囊法。 格子型包埋法格子型包埋法 常用凝膠：聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，海藻酸鈣凝膠，常用凝膠：聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠，明膠等。角叉菜膠，明膠等。 為防止包埋固定化后酶從凝膠中泄漏出來(lái)，凝膠孔徑應(yīng)控為防止包埋固定化后酶從凝膠中泄漏出來(lái)，凝膠孔徑應(yīng)控制在小于酶分子直徑的范圍內(nèi)。因而對(duì)于大分子底物的進(jìn)制在小于酶分子直徑的范圍內(nèi)。

11、因而對(duì)于大分子底物的進(jìn)入和大分子產(chǎn)物的擴(kuò)散出去不利。入和大分子產(chǎn)物的擴(kuò)散出去不利。v微膠囊法（半透膜包埋法）微膠囊法（半透膜包埋法） 定義：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的半透定義：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的半透性小球內(nèi)，制成固定化酶。性小球內(nèi)，制成固定化酶。 小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，稱為微膠囊。小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，稱為微膠囊。v3 共價(jià)法共價(jià)法 定義：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化定義：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。方法。 優(yōu)點(diǎn)；穩(wěn)定性好優(yōu)點(diǎn)；穩(wěn)定性好 缺點(diǎn)：反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制條件缺點(diǎn)：反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制條件 苛刻，相對(duì)酶活力較

12、低?？量?，相對(duì)酶活力較低。v 4交聯(lián)法交聯(lián)法 定義：借助雙功能或多功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作定義：借助雙功能或多功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。 第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶 得到一種分子間交聯(lián)的得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶固定化酶 雙官能團(tuán)能試劑：戊二醛，已二胺，順丁烯二酸酐，雙偶雙官能團(tuán)能試劑：戊二醛，已二胺，順丁烯二酸酐，雙偶氮氮苯氮氮苯 優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用 缺點(diǎn)：交聯(lián)法單用時(shí)，所得到的固定化酶，顆粒小，機(jī)械缺點(diǎn)：交聯(lián)法單用時(shí)，所得到的固定化酶，顆粒

13、小，機(jī)械性能差，酶活性低。性能差，酶活性低。 常與吸附法或包埋法聯(lián)合作用，制備出酶活性高，機(jī)械強(qiáng)常與吸附法或包埋法聯(lián)合作用，制備出酶活性高，機(jī)械強(qiáng)度又好的固定化酶或固定化菌體度又好的固定化酶或固定化菌體。第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶性質(zhì)固定化酶性質(zhì)一穩(wěn)定性一穩(wěn)定性儲(chǔ)存和操作過(guò)程中穩(wěn)定性增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在：儲(chǔ)存和操作過(guò)程中穩(wěn)定性增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在：1熱穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，2蛋白質(zhì)水解酶的抗性，蛋白質(zhì)水解酶的抗性，3變性劑的耐變性劑的耐受性，受性，4保存期延長(zhǎng)。保存期延長(zhǎng)。二反應(yīng)的最適溫度二反應(yīng)的最適溫度 最適溫度比天然酶高。最適溫度比天然酶高。 用用CM-纖維素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜纖維素迭氮衍生物

14、固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比游離酶高蛋白酶的最適溫度比游離酶高515。 采用不同固定化材料，最適溫度不同，如氨基酰采用不同固定化材料，最適溫度不同，如氨基?；?，天然酶最適溫度化酶，天然酶最適溫度60，分別用，分別用DEAE-葡葡聚糖凝膠、聚糖凝膠、DEAE-纖維素固定化的酶纖維素固定化的酶 的最適溫的最適溫度分別為度分別為72和和67。v三反應(yīng)的最適三反應(yīng)的最適pH1 載體性質(zhì)載體性質(zhì)2 產(chǎn)物性質(zhì)產(chǎn)物性質(zhì)微環(huán)境微環(huán)境最適最適pH載體（載體（-）吸引吸引H，pH偏高偏高載體（）載體（）吸引吸引OH-，pH偏低偏低微環(huán)境微環(huán)境最適最適pH產(chǎn)物（酸性）產(chǎn)物（酸性）pH偏高偏高產(chǎn)物（堿性）

15、產(chǎn)物（堿性）pH偏低偏低v 四四. 底物特異性底物特異性 底物專一性：由于空間位阻效應(yīng)，固定化酶對(duì)高分子量底底物專一性：由于空間位阻效應(yīng)，固定化酶對(duì)高分子量底物的活性降低，對(duì)低分子量底物的反應(yīng)速率變化不大。物的活性降低，對(duì)低分子量底物的反應(yīng)速率變化不大。v 五酶活力五酶活力v 活力回收：固定化酶活力活力回收：固定化酶活力/溶液酶活力溶液酶活力;v 相對(duì)活力：固定化酶活力相對(duì)活力：固定化酶活力/溶液酶活力溶液酶活力-殘留酶活力殘留酶活力 酶經(jīng)固定化后大部分活力下降！酶經(jīng)固定化后大部分活力下降！v六六 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Kmv固定化酶的表觀米氏常數(shù)固定化酶的表觀米氏常數(shù) 隨載體的帶電性能隨載體的帶電

16、性能而變化。而變化。v固定化酶催化系統(tǒng)是一種非均相的反應(yīng)系統(tǒng)。以固定化酶催化系統(tǒng)是一種非均相的反應(yīng)系統(tǒng)。以微膠囊包埋法為例，反應(yīng)過(guò)程包括微膠囊包埋法為例，反應(yīng)過(guò)程包括:底物從反應(yīng)底物從反應(yīng)液主體移向載體表面液主體移向載體表面 (底物外部擴(kuò)散底物外部擴(kuò)散);從載體從載體表面移向酶、作用位點(diǎn)表面移向酶、作用位點(diǎn) (底物內(nèi)部擴(kuò)散底物內(nèi)部擴(kuò)散);底物底物被催化生成產(chǎn)物被催化生成產(chǎn)物;產(chǎn)物從反應(yīng)位點(diǎn)移向載體表產(chǎn)物從反應(yīng)位點(diǎn)移向載體表面面;產(chǎn)物再移至反應(yīng)主體液。產(chǎn)物再移至反應(yīng)主體液。第四節(jié)第四節(jié) 固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)固定化酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一一 固定化對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響固定化對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響 1空間效應(yīng)空間效應(yīng)

17、 1)構(gòu)象效應(yīng)：酶在固定化過(guò)程中，由于存在酶和載體的相構(gòu)象效應(yīng)：酶在固定化過(guò)程中，由于存在酶和載體的相互作用，從而引起酶空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致酶催化底物互作用，從而引起酶空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致酶催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變。轉(zhuǎn)化能力的改變。 2)位阻效應(yīng)（空間障礙）：因載體的存在，給酶的活性位阻效應(yīng)（空間障礙）：因載體的存在，給酶的活性部位或調(diào)節(jié)部位造成了空間障礙，使酶的活性下降。部位或調(diào)節(jié)部位造成了空間障礙，使酶的活性下降。2分配效應(yīng)分配效應(yīng)1）固定化酶和主體溶液組成）固定化酶和主體溶液組成固液非均相體系固液非均相體系微環(huán)境：微環(huán)境：固定化酶顆粒附近的環(huán)境固定化酶顆粒附近的環(huán)境宏觀體系：主體溶液體系宏

18、觀體系：主體溶液體系 2）分配效應(yīng)：由于固定化酶載體的親水性、疏）分配效應(yīng)：由于固定化酶載體的親水性、疏水性及靜電作用等引起固定化酶內(nèi)部底物、其水性及靜電作用等引起固定化酶內(nèi)部底物、其他各種效應(yīng)物（他各種效應(yīng)物（H+, OH-離子，溶劑）以及產(chǎn)離子，溶劑）以及產(chǎn)物在微環(huán)境和宏觀體系之間的不等分配，從而物在微環(huán)境和宏觀體系之間的不等分配，從而影響酶反應(yīng)速度的現(xiàn)象。影響酶反應(yīng)速度的現(xiàn)象。3）分配效應(yīng)動(dòng)力學(xué)）分配效應(yīng)動(dòng)力學(xué)簡(jiǎn)化：簡(jiǎn)化： 假定酶被均勻地固定在載體表面，且整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)假定酶被均勻地固定在載體表面，且整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)充分?jǐn)嚢?，混合均勻，排除擴(kuò)散效應(yīng)。充分?jǐn)嚢?，混合均勻，排除擴(kuò)散效應(yīng)。荷電載體與

19、荷電溶質(zhì)靜電作用產(chǎn)生的分配效應(yīng)常用分荷電載體與荷電溶質(zhì)靜電作用產(chǎn)生的分配效應(yīng)常用分配系數(shù)表示配系數(shù)表示分配系數(shù)分配系數(shù)= Si/SSi：代表底物和其他各種效應(yīng)物在微環(huán)境中的局部濃：代表底物和其他各種效應(yīng)物在微環(huán)境中的局部濃度度S：代表底物和其他各種效應(yīng)物在宏觀體系中的總體：代表底物和其他各種效應(yīng)物在宏觀體系中的總體濃度濃度根據(jù)根據(jù)Boltzmann分配定律，荷電溶質(zhì)在分配定律，荷電溶質(zhì)在荷電載體微環(huán)境與外部溶液的分配服從分配系數(shù)可表示為：荷電載體微環(huán)境與外部溶液的分配服從分配系數(shù)可表示為：Si= S =exp-Ze/(KBT)其中，其中，Ze荷電溶質(zhì)的電荷，荷電溶質(zhì)的電荷，荷電載體產(chǎn)生的靜電位

20、，荷電載體產(chǎn)生的靜電位，KB為為Boltzmann 常數(shù)，常數(shù)，T 絕對(duì)溫度絕對(duì)溫度對(duì)固定化酶催化反應(yīng)，分配效應(yīng)僅影響底物濃度分對(duì)固定化酶催化反應(yīng)，分配效應(yīng)僅影響底物濃度分布，酶的動(dòng)力學(xué)方程仍可用米氏方程表示。布，酶的動(dòng)力學(xué)方程仍可用米氏方程表示。 V=Vm Si /(Km+ Si)= Vm S/(Km+S)= Vm S/(Kappm +S) 其中其中Kappm=Km/上式表明，分配效應(yīng)造成的影響是改變上式表明，分配效應(yīng)造成的影響是改變Km。= Si/S Kappm=Km/（1）當(dāng)載體與底物電荷相同時(shí)，）當(dāng)載體與底物電荷相同時(shí)，SiS，1， Kappm Km（2）當(dāng)載體與底物電荷相反時(shí)，）當(dāng)載

21、體與底物電荷相反時(shí)， Si S，1， KappmKm（3）上述效應(yīng)，通過(guò)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，可減弱或消）上述效應(yīng)，通過(guò)提高反應(yīng)系統(tǒng)的離子強(qiáng)度，可減弱或消除除（4）采用疏水性載體，如果底物為極性物質(zhì)或電荷性物質(zhì)，）采用疏水性載體，如果底物為極性物質(zhì)或電荷性物質(zhì)，則則Si S，1， Kappm Km 如果底物為疏水性物質(zhì)，則如果底物為疏水性物質(zhì)，則Si S，1， KappmKm =exp-Ze/(KBT)其中，其中，Ze荷電溶質(zhì)的電荷，荷電溶質(zhì)的電荷，荷電載體產(chǎn)生的靜電位，荷電載體產(chǎn)生的靜電位，KB為為Boltzmann 常數(shù)，常數(shù)，T 絕對(duì)溫度絕對(duì)溫度分配效應(yīng)對(duì)分配效應(yīng)對(duì)H+和和OH-的影響

22、：的影響：H+和和OH-在載體內(nèi)外也呈不等在載體內(nèi)外也呈不等分布。分布。Hi+= H+exp-e/(KBT)-log Hi+ =-log H+exp-e/(KBT)pHi=pH+0.43 e/(KBT)pH= pHi -pH=0.43 e/(KBT) ln expx=xlog expx=-0.429xpHi微環(huán)境微環(huán)境 pH 宏觀環(huán)境宏觀環(huán)境陰離子載體： pH0v pH= pHi -pH=0.43 e/(KBT)3擴(kuò)散效應(yīng)擴(kuò)散效應(yīng) 底物產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在固定化酶載體內(nèi)外之間的遷移底物產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在固定化酶載體內(nèi)外之間的遷移擴(kuò)散速度受到某種限制，造成了不等分布，從而影響反應(yīng)擴(kuò)散速度受到某種限

23、制，造成了不等分布，從而影響反應(yīng)速度。擴(kuò)散效應(yīng)與這些物質(zhì)的分子量大小，載體的結(jié)構(gòu)及速度。擴(kuò)散效應(yīng)與這些物質(zhì)的分子量大小，載體的結(jié)構(gòu)及酶反應(yīng)性質(zhì)有關(guān)。酶反應(yīng)性質(zhì)有關(guān)。 外擴(kuò)散：底物產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在宏觀體系與酶顆粒表外擴(kuò)散：底物產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在宏觀體系與酶顆粒表面間的擴(kuò)散。面間的擴(kuò)散。 內(nèi)擴(kuò)散：在多孔性固定化載體內(nèi)，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)內(nèi)擴(kuò)散：在多孔性固定化載體內(nèi)，底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間的擴(kuò)散。物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間的擴(kuò)散。外擴(kuò)散效應(yīng)動(dòng)力學(xué)假定外擴(kuò)散效應(yīng)動(dòng)力學(xué)假定1、惰性載體，不考慮分配效應(yīng)的影響、惰性載體，不考慮分配效應(yīng)的影響2、酶固定于液

24、體不能滲透的固體膜表面上，排除內(nèi)擴(kuò)散、酶固定于液體不能滲透的固體膜表面上，排除內(nèi)擴(kuò)散效應(yīng)的干擾效應(yīng)的干擾 反應(yīng)過(guò)程：底物從溶液中移向膜表面，底物被酶催化為反應(yīng)過(guò)程：底物從溶液中移向膜表面，底物被酶催化為產(chǎn)物，產(chǎn)物從膜表面移向溶液中。產(chǎn)物，產(chǎn)物從膜表面移向溶液中。v酶促反應(yīng)速度酶促反應(yīng)速度=VmSi/(Km+Si)v底物轉(zhuǎn)移速度底物轉(zhuǎn)移速度=Js(S-Si)Js : 底物轉(zhuǎn)移系數(shù)底物轉(zhuǎn)移系數(shù)當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很快，固定化酶外表面當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很快，固定化酶外表面反應(yīng)速率相對(duì)較慢，并成為該反應(yīng)過(guò)程速反應(yīng)速率相對(duì)較慢，并成為該反應(yīng)過(guò)程速率的控制步驟時(shí)，則率的控制步驟時(shí)，則Si=S,此時(shí)反應(yīng)速率此時(shí)反

25、應(yīng)速率:V=VmSi/(Km+Si) =Vm S/（Km+S）(2) 當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很慢，固定化酶外表面當(dāng)外擴(kuò)散傳質(zhì)速率很慢，固定化酶外表面反應(yīng)速率相對(duì)較快，此時(shí)外擴(kuò)散速率成為反反應(yīng)速率相對(duì)較快，此時(shí)外擴(kuò)散速率成為反應(yīng)的控制步驟，則應(yīng)的控制步驟，則Si=0，此時(shí)反應(yīng)速率為，此時(shí)反應(yīng)速率為:V= Js(S-Si) =JsS當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)處于恒態(tài)時(shí)，酶促反應(yīng)速度和底物傳遞速度相等。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)處于恒態(tài)時(shí)，酶促反應(yīng)速度和底物傳遞速度相等。V=Vm Si/(Km+Si) = Js(S-Si)當(dāng)當(dāng)Km Si時(shí)，則：時(shí)，則：Js(S-Si)= Vm Si/Km Si= JsS/ （Vm /Km+ Js）V=V

26、m Si/Km = S /（1/Js+ Km / Vm ）當(dāng)當(dāng)Js Vm /Km時(shí)，則：時(shí)，則： 1/Js Km / Vm V= Js S （外擴(kuò)散限速）（外擴(kuò)散限速）vThiele準(zhǔn)數(shù)（西勒準(zhǔn)數(shù)準(zhǔn)數(shù)（西勒準(zhǔn)數(shù) ）v= Vm S/Km （酶促反應(yīng)限速）（酶促反應(yīng)限速）v Js S （外擴(kuò)散限速）（外擴(kuò)散限速）v = Vm /Kmv Jsv西勒準(zhǔn)數(shù)西勒準(zhǔn)數(shù) 反映了反映了外擴(kuò)散效應(yīng)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，代外擴(kuò)散效應(yīng)對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，代表外擴(kuò)散效應(yīng)的大小。表外擴(kuò)散效應(yīng)的大小。v 越小，越小，擴(kuò)散效應(yīng)越??；擴(kuò)散效應(yīng)越?。籿越小，越小，擴(kuò)散效應(yīng)越大；擴(kuò)散效應(yīng)越大；v固定化酶受外擴(kuò)散因素的影響，當(dāng)西勒準(zhǔn)數(shù)

27、固定化酶受外擴(kuò)散因素的影響，當(dāng)西勒準(zhǔn)數(shù)值為下列何種情況時(shí)，是酶促反應(yīng)限速，發(fā)酵值為下列何種情況時(shí)，是酶促反應(yīng)限速，發(fā)酵效果較好。效果較好。 v A、=0.1B、=2v C、=10D、=1004微擾效應(yīng)：由于載體的親水，疏水作用和微擾效應(yīng)：由于載體的親水，疏水作用和介電常數(shù)等性質(zhì)，直接影響酶的催化能力介電常數(shù)等性質(zhì)，直接影響酶的催化能力或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力。或酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力。第五節(jié)第五節(jié) 固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用固定化酶及細(xì)胞的應(yīng)用v一酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用一酶在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用v尿激酶尿激酶 激活激活 溶纖維蛋白酶原溶纖維蛋白酶原 活性溶纖維蛋白酶活性溶纖維蛋白酶 溶解溶解纖維蛋白凝塊纖維蛋白凝塊v利用正常細(xì)胞含天冬酰胺合成酶而癌細(xì)胞缺乏利用正常細(xì)胞含天冬酰胺合成酶而癌細(xì)胞缺乏天冬酰胺合成酶天冬酰胺合成酶v天冬酰胺天冬氨酸天冬酰胺天冬氨酸天冬酰胺酶天冬酰胺酶n天冬酰胺合成酶天冬酰胺合成酶v二二 藥用酶的范圍藥用酶的范圍v、由于體內(nèi)有害物質(zhì)的積累所引起的疾病。、由于體內(nèi)