外源性HPV16E7癌基因表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞CyclinE表達(dá)的影響

1、外源性HPV16 E7癌基因表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞Cyclin E表達(dá)的影響【摘要】 目的 研究重組腺病毒介導(dǎo)人乳頭狀瘤病毒(HPV)16型E7病毒癌基因感染對人宮頸癌HeLa細(xì)胞周期蛋白E (Cyclin E)表達(dá)的影響,探討HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重組腺病毒載體感染體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞。免疫熒光染色后激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測感染前后Cyclin E表達(dá)的差異。結(jié)果 HPV16 E7感染后Cyclin E表達(dá)較感染前明顯增加。結(jié)論 HPV16 E7基因的表達(dá)促進Cyclin E的表達(dá)，

2、對宮頸腫瘤細(xì)胞有增殖促進的作用。 【關(guān)鍵詞】 乳頭狀瘤病毒 人 基因 E7 感染 宮頸腫瘤 細(xì)胞周期蛋白E ABSTRACTObjectiveTo investigate the expression of Cyclin E in HeLa cells after the transfection of HPV16 E7 oncogene by recombinant adenovirus vector, and assess the effect of HPV16 E7 oncogene and Cyclin E in the development of human cervical ca

3、rcinoma. MethodsExpression of Cyclin E was detected by laser scanning confocal microscope (LSCM) before and after the transfection. ResultsExpression of Cyclin E protein in the HeLa cells increased significantly after the transfection of HPV16 E7 genes.ConclusionExpression of HPV16 E7 oncogene influ

4、ences the expression of Cyclin E and enhances the proliferation of the cells of cervical carcinoma. KEY WORDSpapillomavirus, human; genes, E7; infection; cervix neoplasms; Cyclin E 宮頸癌是女性高發(fā)惡性腫瘤,在全球女性惡性腫瘤中其發(fā)病率僅次于乳癌,在我國則居首位。人乳頭狀瘤病毒(HPV)的感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要因素。HPV 16/18 DNA 的檢出率在宮頸浸潤癌可達(dá)90%1 。HPV16型E7 (HPV16 E

5、7)病毒癌基因被認(rèn)為是潛在的致癌基因,其編碼的產(chǎn)物可與細(xì)胞內(nèi)癌基因和抑癌基因相互作用而使細(xì)胞失去正常功能,從而導(dǎo)致細(xì)胞惡變。細(xì)胞周期蛋白E（Cyclin E）是G1期細(xì)胞周期蛋白, 在G1晚期調(diào)控和G1/ S期轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用。本研究使用腺病毒表達(dá)載體介導(dǎo)HPV16 E7基因在宮頸癌細(xì)胞株HeLa中表達(dá)，研究HPV16E7病毒癌基因?qū)eLa細(xì)胞周期蛋白Cyclin E的影響，以探討HPV16 E7癌基因和Cyclin E在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 1 材料和方法 1.1 實驗材料 含有HPV16 E7病毒癌基因的重組腺病毒載體為我實驗室所構(gòu)建，并在人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞中包裝成完整

6、腺病毒，置-80 保存。所用載體為AdEasy系統(tǒng)，包含腺病毒骨架質(zhì)pAdEasy1和穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV，其中pAdTrackCMV中含有編碼綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的基因。RPMI 1640、DMEM、血清及TritonX100均購自美國GBICO公司。宮頸癌上皮HeLa 細(xì)胞為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實驗室保存。Cyclin E單克隆抗體購自美國BD公司。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC,美國VECTOR公司）標(biāo)記羊抗鼠IgG。德國ZEISS公司激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM510Meta ）及計算機系統(tǒng)。 1.2 實驗方法

7、1.2.1 細(xì)胞制備 取1瓶生長至90融合的宮頸癌細(xì)胞系HeLa，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞以3 108/ L 濃度接種于含蓋玻片的六孔板中制備細(xì)胞爬片,培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的RPMI 1640。2 d后對其中3孔細(xì)胞進行感染,另3孔仍進行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)作為同期對照。置37 、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 1.2.2 含有HPV16 E7病毒癌基因的重組腺病毒AdE7感染HeLa細(xì)胞 感染時將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無抗生素、無血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液（每孔1 mL），二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育30 min。將病毒上清50 L（病毒滴度31014pfu/L）加至

8、1 mL的RPMI 1640培養(yǎng)基中，輕輕混勻，培養(yǎng)箱中孵育90 min后補加體積分?jǐn)?shù)0.05的完全培養(yǎng)基。36 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。 1.2.3 免疫熒光染色檢測 將細(xì)胞爬片先用預(yù)溫的1 mmol/L磷酸緩沖液（PBS）洗滌5 min,共3次,然后用冰冷的40 g/L多聚甲醛固定1 h。PBS 洗滌5 min，共3次，TritonX100破膜15 min，PBS洗滌后用體積分?jǐn)?shù)0.10羊血清封閉30 min。在各細(xì)胞爬片上分別加入鼠抗人Cyclin E抗體（稀釋濃度為1100),室溫孵育30 min后熒光洗液洗滌5 min，共3 次。然后分別加入TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG

9、(稀釋濃度1100)室溫避光放置30 min, 熒光洗液同上洗滌。最后用無熒光的緩沖甘油封片。抗體稀釋均用體積分?jǐn)?shù)0.10牛血清清蛋白（BSA）溶液。感染HeLa細(xì)胞中選取一孔用PBS 置換一抗作空白對照,未感染HeLa細(xì)胞同樣設(shè)置空白對照。于LSM510Meta激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果,Combi FCS LSMMETA軟件進行分析。用于TRITC檢測的激發(fā)光波長為543 nm,用于GFP檢測的激發(fā)光波長為488 nm。 2 結(jié) 果 感染重組腺病毒后HeLa細(xì)胞在488 nm波長激發(fā)光下胞質(zhì)呈黃綠色,彌漫于整個胞質(zhì),感染率達(dá)80。在543 nm波長激發(fā)光下Cyclin E呈鮮艷的紅色陽

10、性熒光信號，主要分布在胞核中，部分分布在細(xì)胞質(zhì)。對照組熒光染色均呈陰性。 3 討 論 激光掃描共聚焦顯微鏡是近年來發(fā)展起來的一種結(jié)合激光掃描、計算機自動化分析與顯微鏡技術(shù)的新技術(shù)，具有圖像清晰，特異性高、敏感性強的優(yōu)點。由于LSCM是采取激光和被激發(fā)熒光的雙重聚焦技術(shù)，焦點之外的光被擋在擋板以外且不在圖像上成圖，具有細(xì)胞“CT”之稱。LSCM在形態(tài)學(xué)上的直觀性是其他技術(shù)無法比擬的，為蛋白質(zhì)表達(dá)的定位分析提供了更加豐富的生物學(xué)信息。在本實驗中，利用LSCM可以直接觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，從而簡單迅速判定感染成功與否及感染效率的高低。同時，在LSCM下直觀觀察紅色熒光可清晰明了地判定Cyclin

11、 E的定位、定量表達(dá)情況。 目前普遍認(rèn)為，HPV感染及其引發(fā)的抑癌基因功能喪失和細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)是宮頸癌發(fā)病的重要因素。 HPV 感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要病因，HPV的致癌作用主要通過E6、E7實現(xiàn)2。研究表明，HPV16 E7基因編碼的HPV16 E7蛋白能和細(xì)胞內(nèi)的Rb蛋白結(jié)合釋放出E2F，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期的相關(guān)基因表達(dá),促使細(xì)胞進入S期。Cyclin E 是G1 期細(xì)胞周期蛋白, 作為細(xì)胞周期素依賴激酶CDK2的調(diào)節(jié)亞基，與CDK2結(jié)合成復(fù)合物進一步磷酸化pRb使之失活，并釋放轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子E2F；也可作用于BMyb、Rpet等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些轉(zhuǎn)錄因子提高S 期必需基因及Cycli

12、n A 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)中心體的復(fù)制，啟動DNA的合成，促進細(xì)胞進入并加速S 期3。有文獻報道，在直腸癌、乳癌、卵巢癌等多種腫瘤中Cyclin E基因擴增和表達(dá)失調(diào)。而Cyclin E在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用, 國內(nèi)罕見報道。Cyclin E 作為G1 期的一個重要限速因子, 對其進行研究有助于揭示腫瘤細(xì)胞基本的生物特性及真核細(xì)胞周期調(diào)控機制。 本研究使用重組腺病毒載體介導(dǎo)HPV16 E7基因在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，而HeLa細(xì)胞是HPV16陰性、HPV18陽性的宮頸癌細(xì)胞株。本實驗將HPV16 E7基因通過腺病毒表達(dá)載體導(dǎo)入HPV16陰性的人宮頸癌HeLa細(xì)胞，以檢測HPV16 E7基因?qū)?/p>

13、CyclinE蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，HPV16 E7的表達(dá)促進細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin E的表達(dá)。有研究認(rèn)為，HPV16 E7 蛋白可以使宮頸上皮細(xì)胞的抑癌基因產(chǎn)物pRb 失活,導(dǎo)致Cyclin E 基因高表達(dá) 46。HPV16 E7 蛋白還可能直接與Cyclin E及Cyclin E 相關(guān)蛋白結(jié)合,抑制Cyclin E 降解7，確保Cyclin ECDK2復(fù)合物在整個細(xì)胞周期都具有活性8。另外，HPV 16 E6、E7 抑制P21、P27活性9,而P21、P27是目前公認(rèn)的Cyclin E的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子,所以HPV16 E7也有可能通過抑制P21、P27而使Cycli

14、n E表達(dá)增加。 本文實驗結(jié)果表明,HPV16 E7基因的表達(dá)促進細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin E的表達(dá)。Cyclin E與CDK2 形成活性復(fù)合物,參與G1 期和S 期的pRb 磷酸化作用,加速S 期,對DNA復(fù)制的啟動十分重要?？梢酝茰y，HPV16 E7癌基因引起宮頸細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，有可能通過促進細(xì)胞周期蛋白E的表達(dá)而影響細(xì)胞周期進程，導(dǎo)致細(xì)胞增生失控而惡性轉(zhuǎn)化。HPV16 E7 癌蛋白被認(rèn)為可能與腫瘤發(fā)生的早期階段有關(guān)10，而Cyclin E 基因高表達(dá)出現(xiàn)在宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的早期11 。因而HPV16 E7癌基因促進Cyclin E表達(dá)，可能是引起宮頸上皮細(xì)胞早期發(fā)生周期蛋白失

15、調(diào)、周期紊亂、生長失控過程中的重要一環(huán)，在誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生機制中起著關(guān)鍵作用。 【參考文獻】 1丁守怡,吳榮,趙文翠. 女陰及子宮腫瘤人乳頭瘤病毒16和18感染的檢測J. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2000,36(3):183184. 2戴淑真，李旭日，王寧，等. 宮頸癌組織中P16和HPV16/18E7的表達(dá)及意義J. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志， 2004，19（4）：283286. 3邢長英,歸綏琪. 細(xì)胞周期素E與婦科腫瘤研究進展J. 國外醫(yī)學(xué):婦產(chǎn)科學(xué)分冊, 2004,31(6):355359. 4NAM H C, YOUNG T K, JAE W K. Alteration of cell cycle

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