Western-Blot-原理和操作方法(全)

1、Western Blot 原理和操作方法（全）工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)由于無電滲作用,樣品用量少(1-100g),分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的

2、分離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳)的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因為SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME)或二巰基赤蘚醇(DTT),其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級及三級結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時,

3、蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子,這時各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料, 溴酚藍(lán)指示劑是一個較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時,即可停止電泳.另外樣品處理液中也可

4、加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG)制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T)以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C)決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個參數(shù).一般可以由下述公式計算:T%=(a+b)/m*100%; 和 C%=a/(a+b)*100%其中: a=雙體(bis)的重量 ;b=單體(arc)的重量 ;m=溶液的體積(ml)當(dāng)分析一個未知樣品時,常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗,以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度: 蛋白

5、質(zhì)分子量范圍(Da)適宜的凝膠濃度(%)<10420-301×104-4×104 15-204×104-1×10510-151×105-5×1055-10>5×1052-5 蛋白分子量 (kDa)凝膠濃度 (%) 4-40 2012-45 1510-70 12.515-100 1025-200 8分離膠（5ml體積）:(ml)濃度6%8%10%12%15%DDH2O2.62.31.91.61.130%丙烯酰胺混合液1.01.31,72.02.51.5mol/L Tris (pH 8.8)1.31.31,31.31

6、.310% SDS0.050.050.050.050.0510% 過硫酸銨（AP）0.050.050.050.050.05TEMED0.0040.0030.0020.0020.002(ml)體積（ml）12345DDH2O0.681.42.12.73.430%丙烯酰胺混合液0.170.330.50.670.831.0mol/L Tris (pH 6.8)0.130.250.380.50.6310% SDS0.010.020.030.040.0510% 過硫酸銨（AP）0.010.020.030.040.05TEMED0.0010.0020.0030.0040.005 5%的積層膠的配置：蛋白質(zhì)

7、的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個水浴箱，一

8、臺超聲裝置，組織勻漿器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450l裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后425000g離心1小時取上清或以最大強(qiáng)度超聲4

9、次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2)組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體

10、方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。） 蛋白質(zhì)的樣品制備：蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下

11、問題：1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。一：準(zhǔn)備工作：一個水浴箱，一臺超聲裝置，組織勻漿器二：需要的溶液：裂解液 Laemmli樣品緩沖液三：操作步驟：1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：1：胰酶酶解后裂

12、解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450l裂解液反復(fù)吹打。2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時為5S，間歇時間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后425000g離心1小時取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的

13、比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）2)組織樣品的制備：手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時使樣品中的

14、蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）附：一：裂解液的制備：組織裂解液（全細(xì)胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.42: Nacl 150 mmoL/L3: 去氧膽酸鈉 0.25%4：NP-40或Triton-x-100 1%5: EDTA 1 mmoL/L6： PMSF 1 mm

15、oL/L7： Aprotinin 1g/ml8: leupeptin 1g/ml9: pepstain 1g/ml其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。細(xì)胞裂解液：1：NP-40裂解體系：150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-100 50 mmoL/L Tris(PH8.0)2：RIPA裂解體系：150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脫氧膽酸鈉0.1%SDS50 mmoL/L Tris( ph8.0)二：1*loading Buffer樣品緩沖液配置（1*SDS樣品緩沖液）50 mmoL/L Tris-HCL （PH

16、8.0）100 mmoL/L DTT(二硫蘇糖醇)2% SDS0.1% 溴酚藍(lán)10% 甘油此液可以配置成不同的儲存液，根據(jù)蛋白濃度而定，40C長期保存，用時臨時與蛋白液按比例混合，其中DTT應(yīng)臨時加入，以防降解。 蛋白質(zhì)定量1)Bradford法:檢測原理: Bradford與蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測.該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過0.2%影響測定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml

17、 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4至少6個月保持穩(wěn)定.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn),如果待測樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20g -150g/100l之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將待測樣本溶于100l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(最好用PBS)按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過濾除去.每個樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長下測定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過30分鐘.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品

18、的濃度.2)Lowry法:檢測原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測.首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲藏,可穩(wěn)定保存2周,標(biāo)明為試劑A按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲存于琥珀色試劑瓶中,可穩(wěn)定

19、保存1個月,表明為時機(jī)B用蒸餾水將樣本(5-100g)稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,12.5g /ml,4個濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.每個蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘.在750nm光波長下測定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本蛋白質(zhì)的濃度.3)紫外分光光度法:檢測原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.純化蛋白質(zhì)濃度的測定:在280nm波長下讀取與適當(dāng)對照相比較的吸光值.對于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計算其濃度,對其他蛋白質(zhì)粗略地估計:1單位吸光值

20、相當(dāng)于1mg/ml蛋白質(zhì) A280(1mg/ml)IgG 1.35IgM 1.2BSA 0.7含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測定:蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)1)SDS-PAGE設(shè)備和材料電泳裝置（垂直板電泳槽）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。電泳儀（電源）為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。振蕩器2）試劑丙烯酰胺（電泳級）N,N-甲叉雙丙烯酰胺（bis）SDSTEMEDTris過硫酸銨-巰基乙醇或DTT甘油甘氨酸溴酚藍(lán)11鹽酸3）聚膠前準(zhǔn)備：配制凝膠儲液： T%=

21、30% C%=1% arc:bis=29:1過濾后4避光保存。配制濃縮膠緩沖液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 過濾后4避光保存。配制分離膠緩沖液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 過濾后4避光保存。配制10%SDS配制10%過硫酸銨（AP）TEMED原溶液電泳緩沖液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時稀釋5倍至1×SDS電泳緩沖液加入電泳槽中。4)制膠: 制膠關(guān)鍵是聚合時間,最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時間為15-20分鐘（并不是此時已凝聚完全）。對濃縮

22、膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合，可以通過調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來控制，因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合，故用時可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧，灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合，總之，要掌握一個原則：即用盡量少的催化劑在最佳時間聚合。按比例配制分離膠，輕緩地?fù)u動溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，然后靜置90min。同前按比例配制濃縮膠，但搖動溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注

23、意不得在齒尖留有氣泡，靜制90min以上以保證完全聚合。5)預(yù)電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時間的預(yù)電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。6)加樣： 預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品，注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，為避免邊緣效應(yīng)，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。7)電泳： 加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳，通常在連續(xù)系統(tǒng)中，上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進(jìn)入凝膠，電泳時，應(yīng)采用恒壓的模式，這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移

24、率。一般采用恒壓濃縮膠80V，分離膠120V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。8） 轉(zhuǎn)膜：雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分

25、子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。 依據(jù)膠的大

26、小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。  將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜9)染色和脫色電泳完畢需通過染色和脫色評定其結(jié)果的優(yōu)劣.對凝膠中分離成不同條帶的蛋白進(jìn)行檢測.此外,根據(jù)不同的研究目的,也可將凝膠電印跡考馬斯亮藍(lán)染色:將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中

27、到如少量的染色液,以浸沒凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止,一般5-6小時或者4過夜;然后傾去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色稍清亮.,凝膠背景清楚為止.染色液配制:90ml甲醇和H2O混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).脫色液的配制:90mL(甲醇):H2O(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液.附：一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇凝膠電泳中一個關(guān)鍵的指示系統(tǒng)，即蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Molecular Weight Marker），電泳的分離效率，轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動情況

28、等，皆需通過蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品有： Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品，貨號為：prod# 26681; prod# 26691;該標(biāo)準(zhǔn)蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷移，各種分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動情況，當(dāng)相對于目的蛋白大

29、小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與相鄰兩條標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到所需分辨距離時，即可停止電泳，取出凝膠做進(jìn)一步的轉(zhuǎn)膜工作。 Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix 以上也為PIERCE產(chǎn)品，貨號為：prod# 26651，該標(biāo)準(zhǔn)蛋白同上也具有以上作用外，同時在使用化學(xué)發(fā)光時，和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后，在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。 Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix以上為Sigma公司產(chǎn)品，貨號為B2787,作用效果同二、對照的設(shè)置一般需要設(shè)立:內(nèi)

30、參照, 提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白陽性對照, 即肯定可以表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞,同時可以提示你一抗的質(zhì)量陰性對照: 即肯定不會表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞.在實驗中根據(jù)你的需要選擇免疫印跡蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體(或McAb)相應(yīng)的待檢測的蛋白質(zhì)(抗原蛋白),將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過程稱為blotting,以利于隨后的檢測能夠的進(jìn)行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶),再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測樣品的待測抗原并可對其定量.一、 設(shè)備和材料轉(zhuǎn)

31、移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀(電源)震蕩器冰箱濾紙NC膜膠片暗室二、 試劑封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T第一抗體(Ab1)第二抗體(標(biāo)記的Ab2)底物以及顯色指示劑漂洗液(TBS-T)轉(zhuǎn)印緩沖液抗體稀釋液麗春紅S 顯影液定影液三、 試劑的配制封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調(diào)節(jié)PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml轉(zhuǎn)印緩沖液: 同5×SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也

32、可以Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調(diào)節(jié)PH值 ,用時稀釋5倍到1×轉(zhuǎn)印緩沖液.顯影液：H2O-750ml 米土爾-3g 無水亞硫酸鈉-100g 對苯二酚-3g 溴化鉀-3g 無水碳酸鈉：先加5gPH10.0不夠時再加5g注：以上配定加H2O定容至1000ml定影液：起始水溫：60 H2O 700ml硫代硫酸鈉：240g無水亞硫酸鈉：25g冰醋酸：48ml注：加H2o至1000ml四、電印跡蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后，必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性，而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點(diǎn)，常用的支持物有

33、：硝酸纖維膜（NC膜）或PVDF膜。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。一 半干式電轉(zhuǎn)印1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取凝膠方法：用刀片將兩玻璃板分開，將多余的凝膠劃去，上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部棄去，下部以分子量標(biāo)準(zhǔn)最小分子帶下一點(diǎn)全部劃去，取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液，插入玻璃板與凝膠之間注水，使水的壓力將兩者自然分開,邊推邊進(jìn),反復(fù)多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來。2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小，置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤5-10min.3. 按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半干槽

34、中。4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動去除氣泡，然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點(diǎn)，以防電流直接從沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。二濕式電轉(zhuǎn)印1.    Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。2.    打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，

35、夾好電轉(zhuǎn)印夾。3.    電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)（電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷），連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對電泳槽的正極。五、印跡膜上總蛋白的染色在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功,同時,該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性.麗春紅S印跡膜染色法：麗春紅S適用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù), 麗春紅S帶負(fù)電荷,可以與

36、帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合,同時麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色條帶.1)麗春紅溶液的配制:儲存液(10×)： 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液.2)操作步驟轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中,并在室溫下攪動5-10分鐘將膜放入PBS洗數(shù)次,每次1-2分鐘,并且更換PBS根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記至此膜可以用于封閉和加入抗體六、膜的封閉在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬

37、血清以及5% No-fat milk等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk.封閉過程：1) 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。2) 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4度過夜。3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.七、抗體雜交抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上

38、抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢測，標(biāo)記Ab2 物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。雜交過程：）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的Ab1濃度為1ug/ml，封口，4孵育過夜或室溫（22-25）搖動孵育2h.） 液洗膜3次x10min）標(biāo)記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫1h，洗膜3x10min八、檢測根據(jù)標(biāo)記Ab2的標(biāo)記物不同,其雜交的結(jié)果檢測方法也不同,較常用的檢測系統(tǒng)有HRP標(biāo)記 Ab2的的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)和DAB檢測系統(tǒng).1) 辣根過氧化物酶-DAB法:DAB顯色液的配制:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻.顯色:將適量DAB顯色液平鋪在Ab

39、2雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶終止:用Tris-HCl緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng).2) 辣根過氧化物酶-ECL法:增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì),生成一種不穩(wěn)定的中間物質(zhì),其衰變時在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶,利用X線膠片感光原理,將結(jié)果記錄下來:ECM顯色劑配制:按mlH2O加顯色劑A、B各1滴,混勻.在暗室將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液,月1-5分鐘用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多余的顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,并確定干的表面與膠片接觸.將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鐘,沖洗膠片以確

40、定所測抗原的正確暴光時間,暴光時間可短至幾秒也可以長到數(shù)小時.沖洗膠片步驟:先在顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.注意事項:1. 免疫印跡雜交的敏感與檢測系統(tǒng)有關(guān).因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應(yīng)該保證被檢測抗原量不至于太低,如果過低應(yīng)該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳后,直接考馬斯亮藍(lán)染色選擇最佳上樣量,純化和濃縮的蛋白質(zhì)樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析.2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當(dāng),不僅可以決定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質(zhì)量,聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據(jù)不同

41、溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從加入激活劑起至開始出現(xiàn)凝膠凝聚的時間為15-20分鐘最佳,對于濃縮膠最佳聚合時間為8-10分鐘開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合.3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性,操作時應(yīng)該戴手套防護(hù).梳子插入濃縮膠時,應(yīng)確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾斜插入以減少氣泡的產(chǎn)生,梳子拔出來時應(yīng)該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nèi).4. 電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預(yù)電泳,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通(恒壓10-2

42、0V,20-30min)5. 加樣前樣品應(yīng)先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質(zhì)帶的拖尾現(xiàn)象6. 為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液7. 樣品緩沖液中煮沸的樣品可在-20存放數(shù),但是反復(fù)凍融會使蛋白質(zhì)降解8. 為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散,上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印.9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔10. 取出凝膠后應(yīng)注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為標(biāo)記(如左上角)轉(zhuǎn)膜時也應(yīng)用同樣的方法對NC膜做上標(biāo)記(如左上角)以分清正反面和上下關(guān)系.11. 轉(zhuǎn)膜時應(yīng)依次放好NC膜與凝膠所對應(yīng)的電極,即凝膠對應(yīng)負(fù)極,NC膜對應(yīng)正極.注：大蛋白和

43、小蛋白的轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會影響轉(zhuǎn)膜效果，如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率：大蛋白（大于100 KD）   1對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8%或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心，  2  大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便SDS從蛋白上脫失，因此應(yīng)降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。  3  降低電轉(zhuǎn)移

44、緩沖液中甲醇的比例以促進(jìn)凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉(zhuǎn)出。  4 如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜前PVDF需用甲醇活化。  5 選擇濕式，4轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。小蛋白（小于100 KD）  1 SDS妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS。 2  保持20%的甲醇濃度，對于大于500KD的蛋白，請參考下述文獻(xiàn)：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of prote

45、ins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185192 (1997). 更多的轉(zhuǎn)膜注意事項：Ø 避免用直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑Ø 排列三明治時，盡量用移液器或15ml試管趕除膠與膜之間的氣泡，或?qū)⑷髦畏旁谘b有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產(chǎn)生，請戴手套！Ø 確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否

46、剛導(dǎo)致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜無效Ø 雞抗體易于與PVDF膜和其它尼龍膜結(jié)合，導(dǎo)致高背景，請?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。C-3 膜上蛋白的檢測：麗春紅為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色，2%的麗春紅貯備液(20ML)：: 2%麗春紅(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水楊酸(6克)麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10稀釋，即加9 倍的ddH2O   染色方法：將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再進(jìn)行染色）PVD

47、F膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進(jìn)行封閉。10x TBS的配制24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl加約 800 ml 超純水用純HCl調(diào)pH 至7.6 定容至 1 L.TBST的配制配制 1 L TBST：: 量取100 ml  10x TBS + 900超純水 + 1ml Tween20Tween20非常粘稠，用槍頭不易吸取，請確定加入準(zhǔn)確的量，最好用Tris buffer.配成10%的Tween20母液后使用。常見問題分析與解決方案問題可能原因驗證或解決辦法背景高封閉不充分延長封閉時間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA，血清等）一抗?jié)舛冗^高增加一抗稀釋

48、倍數(shù),抗體孵育溫度過高4孵育二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛纫豢够蚨古c封閉劑有交叉反應(yīng)在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng).洗膜不充分增加洗滌次數(shù)膜不合適NC膜比PVDF膜背景低膜干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象沒有陽性條帶或很弱一抗、二抗等不匹配訂購試劑時認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度，延長孵育時間封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶、BSA、血清或明

49、膠一抗不識別目的物種的靶蛋白檢查說明書，或做ClustalW比對，設(shè)陽性對照樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過低（抗原無效）設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔20-30ug蛋白,樣本制備時使用蛋白酶抑制劑,或分級提取目的蛋白。轉(zhuǎn)膜不充分,或洗膜過度使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需正確的轉(zhuǎn)膜操作,勿過度洗膜過度封閉使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間一抗失效使用有效期內(nèi)抗體,分裝保存,避免反復(fù)凍融取用, 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用二抗受疊氮鈉抑制所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑

50、制劑)酶和底物失效直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物,使用新鮮的底物.曝光時間過短延長曝光時間多非特異性條帶或條帶位置不對細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)模式的分化使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實驗體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小蛋白樣本降解使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑新蛋白或同族蛋白的分享同種表位的不同剪接方式查其它文獻(xiàn)報導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說明書報導(dǎo)的細(xì)胞株或組織一抗?jié)舛冗^高降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合降低

51、抗體濃度，增加二抗對照  選擇特異性更強(qiáng)，只針對重鏈的二抗抗體未純化使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶蛋白存在二聚體或多聚體SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性背景有白色/黑色斑點(diǎn)轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動抗體與封閉劑結(jié)合過濾封閉劑暗片現(xiàn)白條帶一抗或二抗加入過多稀釋抗體的濃度目的條帶過低/過高SDS-PAGE膠濃度選擇不合適調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠 “微笑”條帶遷移過快，電泳溫度過高降低電泳速度，低溫電泳（冷室）轉(zhuǎn)膜不充分膜沒有完全均勻濕透使用100% methano

52、l浸透膜靶蛋白分子量小于10,000選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過高過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間 實驗常見的問題指南根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權(quán)作參考，請勿盲目模仿?。?. 參考書推薦A. 對初學(xué)者看什么資料比較好？解答：抗體技術(shù)實驗

53、指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）兩本書不錯。2. 針對樣品的常見問題B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120g，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提

54、高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。E. 同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。F. 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒有問題

55、，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，多加510甲醇。H. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6， Stacking Gel 3.5。I. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的 comb。J

56、. 蛋白變性后可以存放多久？解答： 80，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。K. 我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為105的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。L. 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎？ 解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用代替應(yīng)該好一點(diǎn)M. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？解答：Western Blot一般上樣30100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點(diǎn)時間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。N. 做組織樣品的we