試驗9水中總大腸菌群的測定—多管發(fā)酵法

1、實驗九 水中總大腸菌群的測定一多管發(fā)酵法一.實驗?zāi)康暮鸵? .掌握多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群的技術(shù)。2,預(yù)習(xí)第六章細(xì)菌學(xué)檢驗法的關(guān)內(nèi)容。二.原理總大腸菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。 多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌 群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽抱，呈桿狀等有關(guān) 特性，通過三個步驟進(jìn)行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)（most probable number,簡稱 MPN 表示。三.儀器（1）高壓蒸氣滅菌器。（2）恒溫培養(yǎng)箱、冰箱。（3）生物顯微鏡、載玻片。（4）酒精燈、鍥銘絲接種棒。（5）培養(yǎng)皿（直徑100mm）、試管（5X 150mm）,吸管（1、5

2、、10mL）、燒杯 （200、500、2000mL）、錐形瓶（500、1000mL）、采樣瓶。四.培養(yǎng)基及染色劑的制備1 .乳糖蛋白陳培養(yǎng)液：將10g蛋白陳、3g牛肉膏、5g乳糖和5g氯化鈉加 熱溶解于1000mL蒸儲水中，調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4,再加入1.6%澳甲酚紫乙 醇溶液1mL,充分混勻，分裝于試管中，于 121c高壓滅菌器中滅菌15min,貯 存于冷暗處備用。2 .三倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液：按上述乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的制備方法配制。 除蒸儲水外，各組份用量增加至三倍。3 .品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基：貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL燒杯中，先將2030g瓊脂加到900mL 蒸儲水中，加熱溶

3、解，然后加入 3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白陳，混勻，使其溶 解，再用蒸儲水補(bǔ)充到1000mL,調(diào)節(jié)溶液pH為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨 布過濾，再加入10g乳糖，混勻，定量分裝于250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，置于 高壓滅菌器中，在121c滅菌15min,貯存于冷暗處備用。平皿培養(yǎng)基的制備：將上法制備的貯備培養(yǎng)基加熱融化。 根據(jù)錐形瓶內(nèi)培 養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量的 5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌 試管中；再按比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌試管內(nèi)，加滅菌水少許使其 溶解，再置于沸水浴中煮沸 10min （滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉 溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶

4、液內(nèi)至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。立即將此培養(yǎng)基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi) 備用，但保存時間不宜超過兩周。如培養(yǎng)基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。4 .伊紅美培養(yǎng)基：貯備培養(yǎng)基的制備：于 2000mL燒杯中，先將2030g瓊脂加到900mL 蒸儲水中，加熱溶解。冉家人 2.0g鄰酸二氫鉀及10g蛋白陳，混合使之溶解， 用蒸儲水補(bǔ)充至1000mL,調(diào)節(jié)溶液pH值為7.27.4。趁熱用脫脂棉或絨布過 濾，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250mL或500mL錐形瓶內(nèi)，于121c 高壓

5、滅菌15min,貯于冷暗處備用。第1頁共4頁平皿培養(yǎng)基的制備：將上述制備的貯備培養(yǎng)基融化。根據(jù)錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)基 的容量，用滅菌吸管按比例分別吸取一定量已滅菌的2%紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mLzK中）和一定量已滅菌的 0.5%美藍(lán)水?§液（0.065g美藍(lán)溶于13ml_zK 中），加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡），立即將此培養(yǎng) 基適量傾入已滅菌的空平皿內(nèi)，待冷卻凝固后，置于冰箱內(nèi)備用。5.革蘭氏染色劑：結(jié)晶紫染色液：將20mL結(jié)晶紫乙醇飽和溶液（稱取 48g結(jié)晶紫溶于 100mL95%L醇中）和80mL 1汕酸錢溶液混合、過濾。該溶液放置過久會產(chǎn)生沉 淀，不能再

6、用。助染劑：將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸儲水，充分振蕩，待完 全溶解后，用蒸儲水補(bǔ)充至300mL此溶液兩周內(nèi)有效。當(dāng)溶液由棕黃色變?yōu)榈?黃色時應(yīng)棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸儲水中，臨用前再加水稀釋。脫色劑：95%S醇。復(fù)染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%醇中，待完全溶解后，力口 90mL蒸 儲水。五.測定步驟1 .生活飲用水：初發(fā)酵試驗：在兩個裝有已滅菌的 50mL倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的大 試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣 100mL在10 支裝有已滅菌的5mL倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無菌 操作加入充分混勻

7、的水樣10mL混勻后置于37。叵溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。平板分離：上述各發(fā)酵管經(jīng)培養(yǎng)24h后，將產(chǎn)酸、產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管 分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基或品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，置于 37。叵溫箱內(nèi)培養(yǎng) 24h,挑選符合下列特征的菌落：a.伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或 略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。b.品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶 或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。取上述特征的群落進(jìn)行革蘭氏染色：a.用以培養(yǎng)1824h的培養(yǎng)物涂片，涂層要薄；b.將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結(jié)晶紫溶液，1min后用水

8、洗去；c.滴加助色劑，1min后用水洗去；d.滴加脫色劑，搖動玻片，直止無紫色脫落為止（約2030s）,用水洗去；e.滴加復(fù)染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌， 呈紅色者為陰性菌。復(fù)發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽抱的桿菌，則挑選 該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的試管中 （內(nèi)有倒管）， 每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落 13個，然后置于37c恒 溫箱中培養(yǎng)24h,有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者（不論倒管內(nèi)氣體多少皆作為產(chǎn)氣論），即證 實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表 1 “大腸 菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中

9、的大腸菌群數(shù)。2 .水源水于各裝有5mL倍濃縮乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分第2頁共4頁別加入10mL7K樣；于各裝有10mL乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管）， 分別加入ImLzK樣；再于各裝有10mL乳糖蛋白陳培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒 管），分別加入1mL1 ： 10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混 勻，置于37。叵溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h0平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。根據(jù)證實總大腸菌群存在的陽性管數(shù)，查附表 2 ”最可能數(shù)（MPN表”， 即求得每100mL*樣中存在的總大腸菌群數(shù)。我國目前系以 1L為報告單位，故 MPNS再乘以1

10、0,即位1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。例如，某水樣接種10mL的5管均為陽性；接種1mL的5管中有2管為陽性； 接種1 ： 10的水樣1mL的5管均為陰性。從最可能數(shù)（MPN表中查檢驗結(jié)果5 20,得知100mL*樣中的總大腸菌群數(shù)為49個，故1L水樣中的總大腸菌群數(shù) 為 49X 10=490個。對污染嚴(yán)重的地表水和廢水，初發(fā)酵試驗的接種水樣應(yīng)做1 ： 10、1 ： 100、1 ： 1000或更高倍數(shù)的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。如果接種的水樣量不是10mL 1mL和0.1mL,而是較低或較高的三個濃度的 水樣量，也可查表求得 MPN旨數(shù)，再經(jīng)下面公式換算成每100mL的MPNS：MPN值

11、MPN指數(shù)10(mL)接種量最大的一管(mL)附表1大腸菌群檢數(shù)表接種水樣總量 300mL （100mL2份,10mL10份）10mL水量的陽性管數(shù)100mL*量的陽性瓶數(shù)0121L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)1L水樣中大腸菌群數(shù)0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230第3頁共4頁附表2 最可能數(shù)（MPN表（接種5份10mL水樣、5份1mL水樣、5份0.1mL水樣時，不同陽性及陰性情況下100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)和95%言限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每 100m

12、L水樣中細(xì)菌數(shù)的最 可能數(shù)95%信限 值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100mL水樣中細(xì)菌數(shù)的最可能數(shù)95%信限 值10mL管1 mL管0.1mL管下限上限10mL管1 mL管0.1mL管下限上限000<220171170012<0.5721071170102<0.5721192210204<0.51122092211002<0.57230123281014<0.51130081191104<0.515301112251116<0.515310112251206<0.515311144342005<0.51332014434321175465204917130330175465217023170400133315229428220401175465307925190410175465311103125041121763532140373104122697853318044500420227675401303530042126978541170431904