食品中蛋白質(zhì)的測定方法

1、叮叮小文庫食品中蛋白質(zhì)的測定方法蛋白質(zhì)的測定方法分為兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性， 即含氮量，肽鏈和折射率測定蛋白質(zhì) 含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定蛋白質(zhì)含量。 但是 食品種類很多，食品中蛋白質(zhì)含量又不同， 特別是其他成分，如碳水化合物， 脂肪和維生素的干 擾成分很多，因此蛋白質(zhì)的測定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標準酸液吸收，用標準酸或堿液滴定， 由樣品中含氮量計算出蛋白質(zhì)的含量。 由于食品中蛋白質(zhì)含量不 同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。一凱氏定氮法我們在檢驗食品中蛋白質(zhì)時， 往往只限于測定總

2、氮量， 然后乘以蛋白質(zhì)核算系數(shù)， 得到蛋白質(zhì)含 量，實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗蛋白 質(zhì)。(一) 、常量凱氏定氮法衡量食品的營養(yǎng)成分時， 要測定蛋白質(zhì)含量， 但由于蛋白質(zhì)組成及其性質(zhì)的復(fù)雜性， 在食品分析 中，通常用食品的總氮量表示， 蛋白質(zhì)是食品含氮物質(zhì)的主要形式， 每一蛋白質(zhì)都有其恒定的含 氮量，用實驗方法求得某樣品中的含氮量后， 通過一定的換算系數(shù)。 即可計算該樣品的蛋白質(zhì)含 量。一般食品蛋白質(zhì)含氮量為 l6 ，即 1份氮素相當(dāng)于 6.25 分蛋白質(zhì) ,以此為換算系數(shù) 6.25 ，不同 類的食物其蛋白質(zhì)的換算系數(shù)不同 . 如玉米、高梁、蕎麥

3、 , 肉與肉制品取 6.25 ，大米取 5.95 、小 麥粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取 5.17 ，動物膠 5.55 。測定原理：食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解， 其中氮素以氨的形式與硫酸化合成硫酸銨。 然后加堿蒸餾使氨 游離，用硼酸液吸收形成硼酸銨， 再用鹽酸標準溶液或硫酸標準溶液滴定， 根據(jù)鹽酸消耗量計算 出總氮量，再乘以一定的數(shù)值即為蛋白質(zhì)含量，其化學(xué)反應(yīng)式如下。消化反應(yīng)：有機物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04-t(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02(2) 蒸餾反應(yīng)：(NH4)2SO4+2NAOH2NH3T +2H2O+

4、NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O(3) 滴定反應(yīng)：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2OT2NH4CH+4H3BC或 (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2試劑與儀器：1、硫酸鉀；2、硫酸銅；3、濃硫酸；4、4 %硼酸溶液（飽和溶液）;5、40%氫氧化鈉溶液；6、 混合指示劑：臨用時把 （溶解于95%乙醇的）0甲基紅溶液10毫升和（溶于95%乙醇的0）甲基藍溶液5毫升混合而成；7、 0.1N鹽酸標準溶液或 0.1N硫酸標準溶液；8、凱氏定氮儀一套。9、定氮瓶500ml二只。10、三角瓶250ml 3只。11、量筒 50

5、ml、10ml、100ml。12、吸管 10ml。13、酸式滴定管1支,規(guī)格25ml。14、小漏斗1只。操作方法：1、 樣品消化：精密稱取0.200-2.00g 固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取 10-20ml液體樣品（約 相當(dāng)?shù)?0-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入 0.5g硫酸銅，10g硫酸鉀及20毫升硫酸， 稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將定氮瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，小火加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后， 再繼續(xù)加熱0.5小時。取下放冷，小心加 100ml水，放冷。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫

6、酸，用同一方法做試劑空白試驗。2、 蒸餾、吸收：按圖裝好定氮裝置。接收瓶內(nèi)加入50ml 4%硼酸溶液及混合指示劑5滴，并使冷凝管的下端插入液面下；將70ml 40%氫氧化鈉溶液慢慢通過安全漏斗進入蒸餾燒瓶中，用直火加熱蒸餾30分鐘，移動接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。（接收瓶內(nèi)的溶液呈藍色 ）。3、 滴定：以0.1N鹽酸標準溶液定至溶液灰色或淡紫色為終點。同時作一試劑空白測定除不加樣 品外，叢消化開始操作完全相同。計算：蛋白質(zhì)（）= （V1-V2）X NX 0.014 X F）X 100/ mV1 :樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml

7、;V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml ；N:硫酸或鹽酸標準溶液的當(dāng)量濃度；0.014 : 1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；m樣品的質(zhì)量（體積），g（ ml）；F:氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。注：（1 ）樣品應(yīng)是均勻的，固體樣品應(yīng)預(yù)先研細混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。（2） 樣品放入定氮瓶內(nèi)時，不要沾附頸上，萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低。（3） 消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷后， 慢慢加入30%過氧化氫2-3ml，促使氧化。（4）在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，

8、使氮有損失。（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此 當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。（6 ）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作堿性反應(yīng)的指 示劑。（7）混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。（8） 氨是否完全蒸餾岀來，可用精密PH試紙試餾岀液是否為堿性。（9）以硼酸為氨的吸收液，可省去標定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴格，亦可免去用 移液管，操作比較簡便。（10 ）吸收液也可以用 0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，計算時，A為試劑空

9、白消耗堿液數(shù)，B為樣品消耗堿液數(shù)，N為堿液濃度，其余均相同。（11 ）向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往岀現(xiàn)褐色沉淀物， 這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物Cu（NH3）4+下面我就針對幾點來說明為何影響氨化完全和速度快的因素：（1）K氏燒瓶和取樣量如果稱1g以上的樣品，就需要 K氏燒瓶最小500ml，8001000ml的更好，這樣的 K氏燒瓶對于 縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。（2）分解劑A H2SO4和K2SO4的添加量有機無分解需要 H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機物種類不同而加的量就不同，

10、如果試樣含脂類高， 則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4,但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g 樣品 K2SO4： H2SO4=7g： 12ml這種比例在國內(nèi)外都使用，是公認的還有一種比例：K2SO4： H2SO4=1Q 20mlB催化劑用作催化劑的有 Hg、HgO Se，硒化合物，CuSO4 TiO2，對Hg, HgO有毒但結(jié)果好，Se與CuSO4 得到結(jié)果是一種，TiO2，的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時間不同，HgO消化麥子為38,Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70,所以在給岀測定結(jié)果時要注明催化劑的類

11、型。（3）熱源的強度消化時熱源的強度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導(dǎo)致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關(guān)。（4 ）氨的蒸餾和吸收及滴定蒸餾有兩種：1直接蒸餾（裝置簡便，準確性好）2水蒸汽蒸餾蒸餾加NaOH是50% 加的量為 H2SO4量的4倍，硫酸量為 12ml，貝U NaOH為12X 4=48ml，而且 一般高于這個理論值，即加到 5055ml，如果NaOH量加的不夠就變成 H2S, H2S是強酸，使顏 色變紅。吸收液有：1標準H2SO4用標準堿返滴定，甲醛紅指示劑2硼酸用H

12、CI進行滴定，混合指示劑目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4這樣可省略了反滴定， H2SO4是強酸，要求較嚴，而 硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用 4%6注意事項a. 樣品應(yīng)時均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細，液體樣要混合均勻。b. 樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。c. 消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入 30%過氧化氫催化劑 23ml，促使氧化。d. 在整個消化過程中，不要用強火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁

13、上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。e. 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。f. 混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用 0.1%甲基紅乙醇溶液。g. 氨是否完全蒸餾岀來，PH試紙檢查餾岀液是否為堿性。h. 向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往岀現(xiàn)褐色沉淀無。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。i. 消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。2 K氏微量定

14、氮儀法3 K氏半微量定氮儀法 (2、3原理一樣)操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。計算總氮 =(N(V2-V1)X 0.014)/(W X 10/100) X 100對于微量定氮儀法，儀器有了改進，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。4 K氏自動定氮法原理與上面一樣，儀器，采用K氏自動定氮儀：其裝置內(nèi)具有自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數(shù)字顯示裝置，消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。二水揚酸比色法1原理： 樣品中的pro經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏

15、色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求岀樣品含氮量，計算蛋白質(zhì)含量。2方法(1)標準曲線的繪制取6個25ml容量瓶編號0 1 2 3 4 5 6分別加空白酸液 2ml分別加磷酸鹽緩沖液5ml稀釋至總體體積至 15ml分別加水揚酸鈉 5ml37C水浴15分鐘加入次氯酸鈉2.5ml37C水浴15分鐘取岀試液于660nm下進行比色，繪標準曲線。(2) 樣品處理：準確稱樣0.201.00g t于 K氏瓶中t加15mlH2SO4和5g催化劑電爐上加熱到沸騰后加大火力消化t直到岀現(xiàn)暗綠色時t搖動瓶子TK氏瓶全部消化后t冷卻t加水至250ml容量瓶。(3) 樣品測定：準確吸取上述消化溶液 10mlT

16、于100ml容量瓶中t定容t準確吸2mlT于25ml容量瓶中t加5ml磷酸緩沖液t以下操作與標準曲線繪制的步驟相同并以試劑空白微對照，測得樣液的光密度，從標準曲線查出其含氮量。(4) 計算Cx F含氮 %= X100WX 1000X 1000C-從標準曲線中查岀測定樣液的含氮量(Ug)F-樣品溶液的稀釋倍數(shù)W-樣品重量(g)蛋白質(zhì)=總氮%X K ( K可為6.25，也可查)3注意事項：A當(dāng)天消化液最好當(dāng)天測定，結(jié)果重現(xiàn)性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。B當(dāng)在PH和試劑適當(dāng)范圍內(nèi)加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關(guān)，應(yīng)嚴格控制反應(yīng)溫度。C這種方法測定結(jié)果基本與 K氏法一致。4試劑(1) 氯標液：

17、稱經(jīng) 110C干燥2h的硫酸銨0.4719g于燒瓶中定容10m|f此液1ml相當(dāng)于1.0mg氮標液t使用時配制成1ml相當(dāng)于2.50Ug氮標液。(2) 空白酸液：稱 0.50g蔗糖t加15mlH2SO4和5g催化劑t與樣品一樣消化t定容250mT 使用時吸收此液10m|T加水至100ml為工作液備用。(3) 磷酸鹽緩沖液：稱 7.1g磷酸氫二鈉t加 38g磷酸三鈉t加20g三九石酸鉀鈉t加 400ml 水溶解t過濾t另稱 35gNaOH溶于100ml水中t冷至室溫t緩緩地攪拌加入磷酸鹽溶液中t加入水稀釋至1000ml備用。(4) 水揚酸鈉溶液：稱 25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于2

18、00ml水中過濾，加水稀釋至 500ml(5) 次氯酸鈉溶液：吸 4ml安替富民液，用水稀釋至100ml5儀器(1) 分光光度計(2 )恒溫水浴三紫外分光光度法1原理：pro及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基，在紫外區(qū)內(nèi)對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度(38mg/ml)成直線關(guān)系，因此，通過測定pro溶液的吸光度，并參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品，從標準曲線查岀蛋白質(zhì)的含量。2試劑：(1) 0.1mol/l檸檬酸水溶液。(2) 8mol/l脲(NH2) 2C0的2NNaOH溶液。脲的2N氫氧化鈉液(3) 95%乙醇(4) 無水乙醚3儀器(1) 751型的紫外分光光度計

19、(2) 離心機4操作方法(1)標準曲線的繪制：準確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每秒鐘30005000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸岀上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個10ml容量瓶鐘，每個容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘(如果離心再次離心)，取透明液于比色皿中，在280nm下測定其吸光度。(做參比值)以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質(zhì)的含量微橫坐標上面的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。（2 ）樣品測定準確稱取試樣I.OOgt于50ml燒杯中加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml攪拌10分鐘四層紗布 過濾到離心管中-用 8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測吸光度，從標準曲線上查 岀pro的含量。計算：蛋白質(zhì)=C/WX100C-從標準曲線上查得的 pro含量（mgW-測定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（ mg說明：a. 此法運用于糕點，牛乳和可溶性pro樣品，測定糕點時，應(yīng)把表皮顏色去掉。b. 溫度對pro水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在2030C。四雙縮脲法-皮尼克法1原理：雙縮脲在堿性條件中，能與CuSO4吉合