苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl┐6表達(dá)上調(diào)

1、苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl6表達(dá)上調(diào)作者：張永清黃高升郭英王哲湯蘇陽 【關(guān)鍵詞】苦參堿;K562細(xì)胞 關(guān)鍵詞:苦參堿;K562細(xì)胞;bcl-6;凋亡;PCNA 0引言 自20世紀(jì)80年代即發(fā)現(xiàn)苦參堿具有抗鼠腫瘤的活性1.最近，有人發(fā)現(xiàn)它能抑制人紅白血病K562細(xì)胞增殖2，未見有關(guān)引起細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的報(bào)道.我們研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-6表達(dá)上調(diào)、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)受抑. 1材料和方法 1.1細(xì)胞培養(yǎng)人紅白血病細(xì)胞株K562接種于含100mL・L-1胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37、飽和濕度、50mL&am

2、p;#12539;L-1CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3d換液、傳代1次. 1.2藥品和試劑苦參堿（matrine）購自西安市天其植物化學(xué)藥品公司（純度>0.98，相對(duì)分子質(zhì)量248.36）.抗Bcl-6，PCNA單克隆抗體購自DAKO公司，Westernblot檢測(cè)試劑盒購自德國BOEHRINGERMANNHEIM公司. 1.3苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)增長期K562細(xì)胞分為7組，分別接種于100mL培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（每組105個(gè)），1組為空白對(duì)照，另6組細(xì)胞分別加入0.05，0.1，0.2，0.4和0.5g・L-1苦參堿誘導(dǎo)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，并行細(xì)胞計(jì)數(shù).誘

3、導(dǎo)第7日提取各組細(xì)胞總蛋白，于-20保存?zhèn)溆? 1.4Bcl-6，PCNA檢測(cè)及凋亡細(xì)胞電鏡觀察將對(duì)照組及0.2g・L-1苦參堿誘導(dǎo)組細(xì)胞總蛋白提取液定量為1g・L-1，各取樣品10L，采用Westernblot試劑盒檢測(cè)，按說明操作.對(duì)照組及苦參堿誘導(dǎo)組細(xì)胞制作常規(guī)超薄切片，電子染色，EM-2000EX電鏡觀察. 2結(jié)果 2.1不同濃度苦參堿抗K562細(xì)胞增殖作用苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞48h后，0.1g・L1以上濃度組細(xì)胞均顯示出增生明顯受抑（P<0.01），細(xì)胞數(shù)與苦參堿濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.965），0.4

4、g・L-1和0.5g・L-1組細(xì)胞于第57日呈負(fù)增長.0.2g・L-1濃度組出現(xiàn)部分細(xì)胞呈葡萄串樣聚集，少數(shù)細(xì)胞膨出圓形小泡.當(dāng)濃度大于或等于0.3g・L-1時(shí)，上述現(xiàn)象更為明顯. 2.2Westernblot檢測(cè)Bcl-6及PCNA結(jié)果Westernblot檢測(cè)顯示，對(duì)照組Bcl-6陰性，PCNA呈陽性;0.2g・L-1濃度苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞后，Bcl-6陽性，而PCNA檢測(cè)結(jié)果陰性（圖1）. 2.3苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的電鏡觀察電鏡下見細(xì)胞染色質(zhì)濃集靠邊，呈月芽狀，一些細(xì)

5、胞核染色質(zhì)和胞膜向細(xì)胞外突起，部分脫落形成凋亡小體（圖2）. 3討論 苦參堿是從豆科槐屬植物苦豆子、苦參根中分離得到的生物堿，因其具有抗炎、抗腫瘤及抗心律失常等生物學(xué)活性而受到關(guān)注1.我們通過對(duì)對(duì)照組K562細(xì)胞及苦參堿誘導(dǎo)組K562細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，一般形態(tài)學(xué)觀察及Westernblot檢測(cè)PCNA及Bcl-6蛋白的表達(dá)情況，顯示苦參堿對(duì)K562細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，其抗增殖活性與其濃度呈正相關(guān).PC-NA是DNA聚合酶輔因子，其表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)3.對(duì)照組細(xì)胞PCNA檢測(cè)陽性，而苦參堿誘導(dǎo)組為陰性，提示PCNA表達(dá)受抑可能是苦參堿抗K562細(xì)胞增殖的機(jī)制之一.Bcl-6是位于3q27的原

6、癌基因，其產(chǎn)物Bcl-6過表達(dá)可引起細(xì)胞凋亡4.Westernblot檢測(cè)Bcl-6結(jié)果顯示，0.2g・L-1苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞后，使Bcl-6表達(dá)上調(diào)，光鏡和電鏡觀察細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的特征性形態(tài)改變，說明苦參堿可誘導(dǎo)Bcl-6表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)的Bcl-6可能參與了促使K562細(xì)胞凋亡的分子基礎(chǔ).我們的研究表明苦參堿有望成為一種新的有效的白血病細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑. 圖1略 圖2略 參考文獻(xiàn): 1陶上乘，王靜珍.苦豆子生物堿的藥理作用J.中國藥學(xué)雜志，1992;27:201-204. 2張莉萍，蔣紀(jì)愷，張彥etal.苦參堿對(duì)K562細(xì)胞增殖與分化作用的機(jī)制研究J.中華血液學(xué)雜志，1999;20（6）:315-316. 3PichA，PontiR，ValerteGetal.MIB-1，Ki67，andPCNAscoresandDNAflowcytometryinintermediategrademadignantlymphomasJ.JClinPathol，1994;47:18-22. 4AlbagliO，LantoineD，QuiefSetal.OverexpressedBcl-6（LAZ3）oncoproteintrigge