靶向大鼠CTGF的shRNA表達載體的構建和作用分析

1、靶向大鼠CTGF的shRNA表達載體的構建和作用分析 作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，楊漢東，閔新文 【摘要】 目的: 構建并篩選靶向大鼠結締組織生長因子（CTGF）的shRNA表達載體. 方法: 根據大鼠CTGF mRNA序列設計并構建4個靶向大鼠CTGF基因的shRNA干擾質粒；然后以脂質體轉染試劑將目的質粒轉染至大鼠心肌成纖維細胞，流式細胞技術分選出成功轉染的陽性細胞. 通過RTPCR和Western Blot技術對成功構建的4個shRNA干擾質粒進行有效性篩選，分析其CTGF mRNA及蛋白表達水平. 結果: 酶切證實轉錄shRNA的目的基因片段已成功克隆入載體，經測序證明與設計的相同；在

2、轉染成纖維細胞48 h后，與空白對照組比較，有3組細胞CTGF mRNA及蛋白表達水平明顯降低；而轉染非特異陰性質粒對照組CTGF mRNA及蛋白表達水平無明顯變化. 結論: 成功構建并篩選出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表達質粒重組體，為進一步進行體內外心肌纖維化的RNA干擾研究奠定了基礎. 【關鍵詞】 結締組織生長因子;RNA干擾;質粒;轉染;心內膜；心肌纖維化 【Abstract】 AIM: To construct and screen out the potent shorthairpin RNA (shRNA)expressing plasmids which target to

3、 rat connective tissue growth factor (CTGF). METHODS: Four shRNAexpressing plasmids targeting to rat CTGF mRNA (Accession No: NM_022266) were designed and constructed based on the sequence of rat CTGF mRNA. The recombinant plasmids were identified by restriction enzyme assay and nucleotide sequence

4、analysis. Then the plasmids were transfected into rat cardiac fibroblasts using lipofectamine2000 reagent, and the positive cells were sorted by fluorescence active cell sorting (FACS) technique. The mRNA and protein expressions of CTGF were analyzed by RTPCR and Western Blot technique, and compared

5、 with thatof nontransfection group and negative control plasmid. RESULTS: The 4 recombinant plasmid vectors expressing CTGFtargeting shRNA were identified by restriction enzyme assay and sequence analysis. Fortyeight hours posttransfection, the mRNA and protein expressions of CTGF decreased in 3 exp

6、erimental groups compared with that in nontransfection group, but no changes occurred in negative control plasmid and lipofectamine2000 group. CONCLUSION: Four recombinant plasmids targeting to rat CTGF are successfully constructed, and 3 potent recombinant plasmids are screened out. This lays a fou

7、ndation for further researches of RNA interference on cardiac fibrosis in vivo and in vitro. 【Keywords】 connective tissue growth factor; RNA interference; plasmid; transfect; cardiac fibrosis0引言 結締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一種促組織纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵細胞因子，在多種器質性纖維化疾病如腎間質纖維化、肝硬化、皮膚瘢痕的形成等中均起關鍵作

8、用1-3. 近年來也有研究提示CTGF可能參與了心肌纖維化的發(fā)生4-5. RNA干擾（RNA interference, RNAi）是轉錄后水平的基因沉默技術，是比基因敲除、反義寡核苷酸干擾更有前途的作用于mRNA水平的干擾技術，具有相對簡單、抑制作用更為完全、特異性高等特點，在高通量研究基因功能、信號轉導通路及進行靶向基因靜默治療等方面廣泛應用. 本研究通過構建并篩選CTGF靶向特異性的shRNA（shorthairpin RNA）真核表達載體，為今后通過RNAi技術抑制CTGF表達、從基因與蛋白質水平探索CTGF在促心肌纖維化的作用打下基礎. 1材料和方法 1.1材料真核表達載體pGene

9、sil1質粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5購自武漢晶賽生物工程技術有限公司;限制性核酸內切酶BamH I, Hind , Sal I, Pst I和T4多聚核苷酸激酶及其緩沖液均購自寶生物工程大連有限公司;T4 DNA連接酶及緩沖液購自New England Biolabs;凝膠回收試劑盒和小量質粒提取試劑盒購自寧波中鼎生物技術有限公司;脂質體轉染試劑lipofectamine2000購于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗體購自Santa Cruz;HRP標記的兔抗山羊二抗及ECL試劑盒購于Pierce公司. 1.2方法 1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的設計與合成CTGF靶向性s

10、hRNA干擾序列的設計合成參見文獻6. 簡言之，從GenBank上選取大鼠CTGF的基因序列(序列號NM_022266)，用專業(yè)RNAi設計軟件結合個人經驗優(yōu)選四段序列為靶序列，同時設計一對非特異性序列作為對照，并與大鼠基因組進行BLAST比對，驗證均為單一基因. 然后進行以上寡核苷酸DNA單鏈的合成，并退火連接形成雙鏈. 1.2.2靶向大鼠CTGF的 shRNA表達載體的重組構建及鑒定CTGF靶向性干擾質粒的克隆重組、限制性內切酶分析及測序鑒定參見文獻6. 首先，線性化處理目的質粒，再把基因片段與線性化質粒連接從而克隆重組成新的靶質粒，隨后轉化感受態(tài)細菌DH5，在含Kana抗性（終濃度為20

11、 g/mL）的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，用質粒提取試劑盒提取質粒，將提取得到的重組的陽性克隆質粒用Pst I和Sal I進行酶切分析并進行測序鑒定. 1.2.3大鼠心肌成纖維細胞的分離培養(yǎng)取出生12 d的SD乳鼠(購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心)消毒后無菌操作取心尖組織，剪碎成1 mm3大小，加入適量含0.8 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L膠原酶混合液，37水浴下機械混勻，完全消化，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清，制備成細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶，差速貼壁60 min去除心肌細胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37, 50 mL/L CO2

12、培養(yǎng)環(huán)境中恒溫培養(yǎng). 以后每2 d換液1次，待細胞鋪滿瓶底后傳代繼續(xù)培養(yǎng). 取第3代細胞進行后續(xù)實驗. 1.2.4心肌成纖維細胞的基因轉染及流式分選將培養(yǎng)至第3代的心肌成纖維細胞以1.25 g/L胰酶消化離散，接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪板密度達90%左右時，進行轉染實驗. 實驗分為如下6組：空白對照組（即單純細胞組）,陰性對照HK質粒組,1號質粒組,2號質粒組,3號質粒組,4號質粒組. 參照脂質體轉染試劑Lipofectamine2000試劑盒操作說明轉染細胞. 為純化轉染成功的陽性細胞，于轉染后48 h后對所有質粒轉染組（14號質粒及陰性HK質粒）進行流式細胞分選. 分選出的5組細胞及空

13、白對照細胞進入后續(xù)的篩選實驗. 1.2.5RNA的提取及半定量RTPCR檢測根據實驗分組，在刺激時相點結束后，加入TRIZOL提取細胞總RNA，以30 L去RNase水溶解，采用紫外分光光度儀測定濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的質量. RTPCR檢測采用兩步法進行. 逆轉錄過程以Random 9 mers為隨機引物，AMV為逆轉錄酶，反應條件為：30保溫10 min,44聚合延伸30 min, 99滅活逆轉錄酶5 min, 5穩(wěn)定5 min. PCR過程以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照. CTGF上下游引物序列分別為5GCTGGGGCTCACCTGAAGG3和5GGATGACCT

14、TGCCCACAGCC3，擴增長度499 bp; GAPDH上下游引物序列分別為5CCTGACCCAACTATGATGC3和5CCCTTACTCCCTGGCTTT3，擴增長度為343 bp. 引物均用Primer5.0設計，送上海生物工程有限公司合成. PCR反應條件如下：95變性5 min； 然后95變性1 min,55退火1 min,72延伸1 min,共計30個循環(huán)；最后72延伸7 min. PCR產物經15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，拍照并經過凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳帶進行分析，測定各目的基因和GAPDH擴增產物的吸光值，分別計算其比值. 1.2.6蛋白提取及Western Blot檢測根

15、據實驗分組，以冰PBS洗滌細胞，按照5106個細胞加入50uL蛋白裂解液提取細胞總蛋白，蛋白提取液在4條件下以12 000 g離心20 min，取上清，采用紫外分光光度儀用Bradford方法測定蛋白濃度后分裝，-70保存. 取上述細胞蛋白提取液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）. 將電泳分離后的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，置于50 g/L脫脂奶粉的PBS中封閉3 h后分別加入CTGF（1400），F(xiàn)N（1500）多克隆抗體4孵育過夜后，硝酸纖維素膜用3 g/L的TweenPBS液反復沖洗3次，每次15 min. 將沖洗后的膜置于辣根過氧化物酶標記的IgG中，室溫下?lián)u床上孵育2 h.

16、用3 g/L的TweenPBS液反復沖洗3次，每次15 min. 并以兔抗大鼠actin（1500）多克隆抗體同上操作，作為上樣對照. 抗原抗體復合物用增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence, ECL）法顯影，暗室X光膠片曝光，采用GELW4D軟件分析蛋白條帶的積分光密度值（integrated optical density, IOD=平均光密度面積），以IOD靶蛋白/IODactin的比值反映靶蛋白相對水平. 統(tǒng)計學處理: 用SPSS12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學處理, 數(shù)據以xs表示，多個均數(shù)比較用單因素方差分析,兩個均數(shù)比較用t檢驗. P<0.05為

17、有統(tǒng)計學差異. 2結果 2.1選定的靶序列及針對每條靶序列設計的雙鏈shRNA靶序列結構模式：BamHI+Sense+Loop+Antisense+ 終止信號+SalI+HindIII CTGF1: AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC; CTGF1A: 5GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3; CTGF1B: 3GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF2: AAAGATGGTGCACCCT

18、GTGTC; CTGF2A: 5GATCCAGATGGTGCACCCTGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3; CTGF2B: 3GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF3: GAGTCCTTCCAAAGCAGTT; CTGF3A: 5GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3; CTGF3B: 3GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATAC

19、CTGTTTGACGAAACCTTCCTGAGAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF4: CCGATGGCGAGATCATGAA; CTGF4A: 5GATCCGCCGATGGCGAGATCATGAATTCAAGACGTTCATGATCTCGCCATCGGTTTTTTGTCGACA3; CTGF4B: 3GCGGCTACCGCTCTAGTACTTAAGTTCTGCAAGTACTAGAGCGGTAGCCAAAAAACAGCTGTTCGA5. 以上各序列中畫橫線部分為正義及反義序列，斜體加粗部分為shRNA的環(huán)區(qū)序列，兩端的框中為BamHI和Hind部分酶切殘基，退火成雙鏈后能夠形成酶切

20、位點的粘性末端，可與工具質粒相應的黏性末端連接；其余部分為終止信號+SalI. 構建好的質粒重組體分別命名為CTGF14. 2.2心肌成纖維細胞瞬時轉染以Lipofectamine2000轉染心肌成纖維細胞2448 h后，倒置熒光顯微鏡下可見各轉染組心肌成纖維細胞在成功轉染后可被激發(fā)出亮綠色熒光，粗略估測轉染效率約30%40%（圖1）. 圖1熒光顯微鏡下瞬時轉染效果100 2.3心肌成纖維細胞的流式分選流式細胞分選表明，以Lipofectamine2000進行心肌成纖維細胞的質粒轉染，瞬時轉染效率僅約為30%（圖2）. M1:成功轉染的細胞比率; A:陰性對照; B:陽性轉染細胞. 圖2心肌成

21、纖維細胞流式分選結果 2.4不同實驗組心肌成纖維細胞CTGF mRNA的表達半定量RTPCR結果顯示，序列非特異性的陰性對照質粒成功轉染心肌成纖維細胞后對細胞CTGF基因表達無下調效應.4個待篩選的目標質粒轉染后，表現(xiàn)出不同的抑制效應，其中在轉染1號質粒的細胞未表現(xiàn)出抑制效果，轉染2, 3, 4號質粒后有明顯抑制效應，尤其以3號質粒基因沉默作用最強（圖3）. 2.5不同實驗組心肌成纖維細胞的CTGF蛋白表達水平結果顯示，序列非特異性的陰性對照質粒成功轉染后對細胞CTGF蛋白表達無下調效應；4個待篩選的目標質粒轉染后， 1號質粒未表現(xiàn)出任何抑制效果，2, 3, 4號質粒有明顯抑制效應，尤其以3號

22、質粒抑制作用最強，約75%（圖4）. 3討論 CTGF是近年來國內外研究的熱點之一， 它可能是TGF1促纖維化活性的下游信號介質，刺激細胞增殖及細胞外基質的形成，在組織纖維化中有重要作用. 研究發(fā)現(xiàn)在高血壓、粥樣硬化病變中以及心肌梗死灶中CTGF表達明顯增高，并與纖維化指標正相關，提示CTGF可能是致心肌纖維化的關鍵性中間環(huán)節(jié)7-9. 通過靶向抑制CTGF從而抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展理論上是抗纖維化的有效方式，已有研究應用抗CTGF的單克隆抗體FG3019或針對CTGF的反義寡核苷酸用于抑制腎間質纖維化、肺纖維化并取得一定進展10-11. RNA干擾（RNAi）是作用于mRNA水平的基因沉默技術

23、,其機制可能是細胞內雙鏈RNA在Dicer酶的作用下，可形成2123 bp大小的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，精確降解與siRNA序列相同的mRNA，抑制了該基因在細胞內的翻譯和表達從而達到轉錄后水平的基因靜默12-15. 由于siRNA表達載體成功轉染后可進行瞬時或穩(wěn)定的基因沉默，因此相較于化學合成的siRNA更有應用價值和前景. 本研究應用OptiRNA設計軟件結合個人經驗設計了4條針對大鼠CTGF基因的靶向干擾序列，經BLAST證實與大鼠基因組其他基因無同源性，因此具備了靶向特異性的特點. 我們構建的CTGFshRNA質粒重組體使用了U6啟動子啟

24、動shRNA的轉錄以及Pol識別的終止信號終止轉錄，符合siRNA表達載體的設計要求；通過酶切實驗和基因測序也證實目標質粒構建成功. 另外，本質粒含有增強型綠色熒光蛋白編碼基因，成功轉染后能在細胞內借助U6啟動子轉錄出綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀可非常方便的評估轉染效率或進行細胞分選，為成功的RNA干擾實驗提供支撐. 由于我們早期進行的預實驗發(fā)現(xiàn)用脂質體轉染試劑Lipofectamine2000對心肌成纖維細胞進行質粒轉染其轉染效率僅有30%40%，達不到進行理想的基因干擾實驗的要求. 因此，為了提高篩選結果的準確性和可信度，本實驗對轉染細胞進行了流式分選. 由于

25、分選出的陽性細胞基本上都是已經成功轉染目的質粒的心肌成纖維細胞，因此最大限度減少了篩選實驗假陰性結果的發(fā)生. 通過檢測CTGF mRNA與蛋白的表達水平，我們比較了4個目標質粒及陰性對照質粒轉染組細胞與非轉染細胞的表達差異. 結果表明，CTGF2,3,4號干擾質粒均可有效地抑制CTGF mRNA及蛋白的表達，尤其以3號干擾質?；虺聊Ч鼮轱@著，抑制效率可達75%以上，說明CTGF shRNA可高效特異抑制CTGF的表達. 而CTGF1干擾質粒無明顯抑制效率，說明并非所有設計的siRNA均可有效地抑制靶基因的表達，因此，RNA干擾實驗要求通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有

26、效的siRNA序列. 陰性對照組與空白對照組相比CTGF mRNA表達無明顯改變，排除了質粒載體本身、非特異性的靶基因對CTGF基因表達的影響. 綜上所述，本研究成功設計并構建了4個靶向CTGF的shRNA質粒，并通過篩選實驗獲得了高效及靶向特異的目標質粒. 為后續(xù)心肌纖維化的體內外RNA干擾研究及進一步探索CTGF在心肌纖維化及心臟的組織重塑中的地位與作用奠定了基礎.【參考文獻】 1 Duncan MR, Frazier KS, Abramson S, et al. Connective tissue growth factor mediates transforming growth fa

27、ctor beta induced collagen synthesis: Down regulation by cAMPJ. FASEB,1999,13:1774-1786.2 郭長梅，惠延年，閻峰,等. 視網膜增生膜結締組織生長因子mRNA的表達J.第四軍醫(yī)大學學報，2003，24（13）：1172-1174.3 Mori T, Kawara S, Shinozaki M, et al. Role and interaction of connective tissue growth factor with transforming growth factor beta in persis

28、tent fibrosis: A mouse fibrosis modelJ.J Cell Physiol,1999,181(1):153.4 Ahmed MS, Oie E, Vinge LE, et al. Connective tissue growth factora novel mediator of angiotensin IIstimulated cardiac fibroblast activation in heart failure in ratsJ. J Mol Cell Cardiol, 2004, 36: 393-404.5 Kemp TJ, Aggeli IK, S

29、ugden PH, et al. Phenylephrine and endothelin1 upregulate connective tissue growth factor in neonatal rat cardiac myocyteJ. J Mol Cell Cardiol, 2004,37(2):603-606.6 郎明健,曾秋棠,郭敏,等.大鼠結締組織生長因子短發(fā)夾RNA干擾質粒重組體的構建和鑒定J. 臨床心血管病雜志,2007,23（1）：51-55.7 Chen M, Lam A, Abraham JA, et al. CTGF expression is induced by TGFbetal in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes: A potential role in heart fibrosis J. J Mol Cell Cadiol, 2000,32(10): 1805-1819.8 Piet F, Kaija I, Juhani A, et al. Angiotension II induces connective tissue growth factor gene expression via calcineuri