畢赤酵母發(fā)酵手冊(cè)

1、畢赤醉母發(fā)醉手冊(cè)總覽簡(jiǎn)介:畢赤酵母和釀酒酵母很相似,都非常適合發(fā)酵生長(zhǎng).畢赤酵母在有可能提升總體的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的發(fā)酵中能夠到達(dá)非常高的細(xì)胞濃度,我們建議只有那些有過(guò)發(fā)酵經(jīng)驗(yàn)或者能得到有經(jīng)驗(yàn)的人的指導(dǎo)的人參與發(fā)酵.由于發(fā)酵的類(lèi)型很多,所以我們很難為您的個(gè)人案例提升詳細(xì)的過(guò)程.下面所給出的指導(dǎo)是基于Mut+和Muts兩種基因型的畢赤酵母菌株在15L的臺(tái)式玻璃發(fā)酵罐中發(fā)酵而成.請(qǐng)?jiān)谀陌l(fā)酵開(kāi)始前先閱讀操作員手冊(cè).下面所給出的表就是整個(gè)指導(dǎo)的概況.步驟標(biāo)題貝碼1發(fā)酵參數(shù)12設(shè)備推薦和培養(yǎng)基的制備23培養(yǎng)中溶氧的測(cè)量和使用34種子液的培喬415在分批和分批補(bǔ)料培養(yǎng)中生物量對(duì)應(yīng)于甘油的生成4-56Mut+和

2、Muts基因型重組子在甲醇分批補(bǔ)料狀態(tài)下表達(dá)的介紹6-77細(xì)胞的成熟與宸退88參考文獻(xiàn)9-109配方11發(fā)酵參數(shù):在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)和調(diào)控以下參數(shù)非常重要.下面的表格描述了這些參數(shù)和監(jiān)測(cè)這些參數(shù)的原因.參數(shù)原因溫度(30C)在32c以上的溫JT下生長(zhǎng)不利于蛋白質(zhì)的表達(dá)溶氧20%畢赤酵母利用甘油和甲醇需要氧氣pH(5.0-6.0和3.0)對(duì)于外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中和最適生長(zhǎng)非常重要轉(zhuǎn)度(500-1500rpm)使培養(yǎng)基中的氧濃度到達(dá)最大值通氣玻璃發(fā)酵罐中為0.1-1.0vvm使培養(yǎng)基中的氧濃度到達(dá)最大值取決于容器消泡劑消除泡沫的最小量過(guò)多的泡沫會(huì)引起分泌蛋白質(zhì)的降低和罐頂空間的減少碳源變化率在

3、發(fā)酵過(guò)程中要以不同的速率添加不同的碳源每分鐘1體積發(fā)酵液L中氧氣的體積L設(shè)備推薦：下面是所推薦設(shè)備的清單：發(fā)酵罐的夾套需要在發(fā)酵過(guò)程中給酵母菌降溫,尤其是在甲醇流加過(guò)程中.你需要一個(gè)固定的來(lái)源來(lái)提供冷卻水5-10Co這可能意味著你需要一個(gè)冷凍裝置來(lái)保持水的冷卻.一個(gè)泡沫探針就像消泡劑一樣不可或缺.一個(gè)氧氣的來(lái)源空氣不銹鋼的發(fā)酵罐需要1-2vvm或者純氧玻璃發(fā)酵罐需要0.1-0.3vvm.添加甘油和甲醇的補(bǔ)料泵.pH的自動(dòng)限制.培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：你需要準(zhǔn)確配置以下溶液：發(fā)酵所需的根本鹽類(lèi)第11頁(yè)P(yáng)TM1補(bǔ)充鹽類(lèi)第11頁(yè)75ml的50%的甘油每升初始發(fā)酵液,12ml的PTM1補(bǔ)充鹽每升甘油.740ml

4、的100%的甲醇每升初始發(fā)酵液,12ml的PTM1補(bǔ)充鹽每升甲醇.畢赤酵母生長(zhǎng)的測(cè)定：在不同的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)測(cè)OD600的吸光值和濕細(xì)胞的重量來(lái)檢測(cè)畢赤酵母的生長(zhǎng).培養(yǎng)的代謝速率通過(guò)通過(guò)觀察溶氧濃度對(duì)應(yīng)于有效碳源來(lái)測(cè)定.溶氧的測(cè)定:簡(jiǎn)介：溶解氧的濃度時(shí)指氧氣在培養(yǎng)基中的相關(guān)比例,溶氧100%是指培養(yǎng)基中氧到達(dá)飽和.畢赤酵母的生長(zhǎng)需要消耗氧氣,減少溶解氧的滿(mǎn)度.畢赤酵母在生長(zhǎng)時(shí)會(huì)消耗氧氣,減少溶氧的程度.然而,由于代謝甲醇的最初階段需要氧氣,所以將溶氧濃度維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃?0%來(lái)保證畢赤酵母在甲醇上的生長(zhǎng)就至關(guān)重要.準(zhǔn)確測(cè)定和監(jiān)測(cè)培養(yǎng)中的溶氧濃度將會(huì)為您提供關(guān)于培養(yǎng)狀態(tài)和健康程度之類(lèi)的重要信息.

5、因此,精確校正您的發(fā)酵設(shè)備非常重要,請(qǐng)查閱您的操作手冊(cè).溶氧濃度的維持：1、很難依靠發(fā)酵罐的氧氣轉(zhuǎn)換速率OTR將溶氧濃度維持在20%,特別是在小型的玻璃罐中.在玻璃發(fā)酵罐中,通氣一般約為0.1-0.3vvm1L發(fā)酵液每分鐘1L氧氣來(lái)提供氧氣使DO保持在20%.氧氣消耗的變化依賴(lài)于所添加的甲醇的總量和蛋白質(zhì)的表達(dá).2、 在通氣為0.1-0.3vvm時(shí),氧氣可到達(dá)足夠的水平,這在許多玻璃發(fā)酵罐中可以通過(guò)通入無(wú)菌空氣來(lái)實(shí)現(xiàn).在不銹鋼發(fā)酵罐中,壓力可增加OTR與KLa有關(guān).3、如果一個(gè)發(fā)酵罐不能提供足夠水平的氧氣,甲醇的添加需要因此適當(dāng)降低.請(qǐng)注意降低甲醇的總量可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)水平的降低.4、為了使

6、蛋白質(zhì)表達(dá)水平到達(dá)最大,發(fā)酵時(shí)間應(yīng)被分割來(lái)以較低的流加速度添加相似水平的甲醇.對(duì)許多重組蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō),可以觀察到甲醇消耗的總量和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的總量有直接的關(guān)系.DO測(cè)量的用處：在畢赤酵母生長(zhǎng)階段,消耗氧氣而使DO濃度維持在較低水平.請(qǐng)注意不管是在甘油或甲醇中生長(zhǎng),都要消耗氧氣.DO濃度可用來(lái)衡量代謝速率和碳源是否受抑制,代謝速率那么是培養(yǎng)健康程度的一個(gè)指標(biāo).如果你希望能夠完全的誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子,確定碳源是否受抑制就非常重要.例如：DO濃度的改變可讓你確定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗盡,其次還可以確定甲醇流加的速率是否超過(guò)消耗的速率.過(guò)多的甲醇1-2%vvm可能會(huì)產(chǎn)生毒害.DO的調(diào)控：如果碳源

7、受到抑制,關(guān)閉碳源的添加將會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)理工甲醇的速率降低,DO值會(huì)上升.終止碳源的添加,觀察在碳源的流加關(guān)閉后需要多長(zhǎng)時(shí)間來(lái)使DO值上升10%.如果延遲時(shí)間很短1min,說(shuō)明碳源受抑制.發(fā)醉的準(zhǔn)備和爐油批式發(fā)醉發(fā)酵種子液的搖瓶培養(yǎng)：記住不要向搖瓶中參加太多的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基體積應(yīng)該在搖瓶總體積的10-30%左右.1、搖瓶中包含約為初始發(fā)酵液體積5-10%的從MD或MGY平板上的一個(gè)菌落或者冷凍甘油儲(chǔ)藏液中接種的MGY或BMGY.2、搖瓶應(yīng)該30C,250-300rpm的搖床上培養(yǎng)16-24h直到OD600=2-6.為了精確的測(cè)量OD6001.0,在讀數(shù)前將樣液稀釋10倍.甘油批式發(fā)酵：1、將發(fā)酵罐

8、和包含4%甘油的發(fā)酵根底鹽類(lèi)培養(yǎng)基滅菌.2、在滅菌和冷卻后,待溫度降至30c時(shí),開(kāi)啟攪拌和通氣至操作環(huán)境通常為最大轉(zhuǎn)速和0.1-1.0vvm并用28%的氨水未稀釋將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到5.0.每升培養(yǎng)基中參加4.35ml無(wú)菌的PTM1根底鹽類(lèi).3、從種子液搖瓶中接種初試發(fā)酵體積5-10%的種子液到發(fā)酵罐內(nèi).請(qǐng)注意在培養(yǎng)開(kāi)始先DO值接近于100%.當(dāng)開(kāi)始培養(yǎng)后會(huì)消耗氧氣,導(dǎo)致DO值下降.請(qǐng)?zhí)砑铀柩鯕庖员ＷCDO值超過(guò)20%.4、進(jìn)行批式發(fā)酵直到甘油被完全消耗18-24h,標(biāo)志是DO值增加到100%.請(qǐng)注意甘油完全消耗的時(shí)間會(huì)隨著初試發(fā)酵液密度而變化.5、每個(gè)發(fā)酵階段的完成都需要進(jìn)行取樣,并且每天至

9、少兩次.每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10ml樣品,并從10ml中另取出1ml樣品.樣品用于分析細(xì)胞的生長(zhǎng)OD600和細(xì)胞濕重,pH,顯微觀察,蛋白質(zhì)的濃度或活性.將菌體和上清離心后在-80C下保藏,用于后面的分析.再進(jìn)行第5頁(yè)的甘油補(bǔ)料培養(yǎng).這個(gè)階段所期望到達(dá)的細(xì)胞產(chǎn)量為90-150g/L濕細(xì)胞.重組蛋白質(zhì)由于缺乏甲醇的誘導(dǎo)而不會(huì)產(chǎn)生.方油補(bǔ)料培養(yǎng)介紹：一旦所有的甘油在批式發(fā)酵培養(yǎng)中耗盡,甘油的補(bǔ)料需要馬上開(kāi)始來(lái)在限制條件下增加細(xì)胞生物量.當(dāng)你準(zhǔn)備進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)時(shí),你需要通過(guò)DO值來(lái)確定甘油已耗盡.甘油補(bǔ)料培養(yǎng)：1、 參加50%w/v的每升含12mlPTM1的甘油進(jìn)行補(bǔ)料.將補(bǔ)料速率設(shè)為18.15ml每小時(shí)每升

10、初試發(fā)酵液體積.2、甘油補(bǔ)料將進(jìn)行約4h或更長(zhǎng).在本階段完成后細(xì)胞產(chǎn)量應(yīng)到達(dá)180-220g/L濕細(xì)胞但是不會(huì)有重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生.注息：蛋白質(zhì)的表達(dá)水平依賴(lài)于在甘油補(bǔ)料培養(yǎng)中所產(chǎn)生的細(xì)胞量.補(bǔ)料持續(xù)時(shí)間將會(huì)變化來(lái)使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量到達(dá)最優(yōu),建議的大致的范圍為50-300g/L濕細(xì)胞.4%甘油的是所建議的在補(bǔ)料中的最大水平,更高的甘油濃度將會(huì)產(chǎn)生毒害問(wèn)題.重要：如果溶氧低于20%,應(yīng)該停止甘油或甲醇的補(bǔ)料并且不做任何提升溶氧的事直到溶氧穩(wěn)定.這時(shí)開(kāi)始調(diào)整攪拌、通氣、壓力或氧氣的補(bǔ)充.蛋白酶：在文獻(xiàn)中,有報(bào)道稱(chēng)如果培養(yǎng)基的pH低于3.0,中性蛋白酶會(huì)被抑制.如果你認(rèn)為中性蛋白酶降低了你的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量,

11、在甘油補(bǔ)料培養(yǎng)中或者在甲醇誘導(dǎo)的開(kāi)始階段將pH限制設(shè)定點(diǎn)改為3.0并且允許培養(yǎng)的代謝活動(dòng)在低于3.0的pH條件下進(jìn)行4-5h(Brierley,etal.,1994；Siegel,etal.,1990).甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)簡(jiǎn)介：在甲醇補(bǔ)料來(lái)充分誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子前左右的甘油都必須消耗干凈.然而,有報(bào)道稱(chēng)甘油和甲醇的混合補(bǔ)料已經(jīng)成功的表達(dá)了重組蛋白質(zhì)Breerley,etal.,1990;Sreekrishnaetal.,1989.慢慢的流加甲醇來(lái)使培養(yǎng)適應(yīng)在甲醇中生長(zhǎng)非常重要.如果甲醇加德太快將會(huì)殺死細(xì)胞.一旦培養(yǎng)物適應(yīng)了甲醇,用DO值來(lái)分析培養(yǎng)的狀態(tài)并且來(lái)確定甲醇流加的時(shí)間點(diǎn)來(lái)使蛋白質(zhì)的表達(dá)到達(dá)最

12、優(yōu).在甲醇上生長(zhǎng)液會(huì)產(chǎn)生大量熱量.所以這個(gè)階段溫度的限制非常重要.Mut+型菌株的甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)：1、終止甘油的補(bǔ)料并且開(kāi)始用含12mlPTM1根本鹽類(lèi)每升的100%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo).設(shè)定補(bǔ)料速率為3.6ml/h每升初試發(fā)酵液體積.2、 在開(kāi)始的2-3h內(nèi)甲醇會(huì)在發(fā)酵液中累積,培養(yǎng)物適應(yīng)甲醇的過(guò)程中溶氧值會(huì)有變化.3、如果DO值不能維持在20%以上,停止流加甲醇,等到DO值穩(wěn)定后繼續(xù)以當(dāng)前速率流加甲醇.增加攪拌、通氣、壓力或者氧氣的補(bǔ)充來(lái)使DO維持在20%以上.4、當(dāng)培養(yǎng)物完全適應(yīng)利用甲醇2-4h并且甲醇成為其限制性生長(zhǎng)因子后,將會(huì)有一個(gè)穩(wěn)定的DO讀數(shù)和一個(gè)較快的DO穩(wěn)定時(shí)間點(diǎn)通常不到1min.在

13、培養(yǎng)物適應(yīng)甲醇后而將流加速率翻倍前在限制條件下保持這個(gè)較低的流加速率最少1h.然后流加速率增加一倍到約7.3ml/h每升初始發(fā)酵液體積.5、在以7.3ml/h/L的速率流加2h后,增大甲醇流加速率到10.9ml/h每升初始發(fā)酵液體積.這個(gè)流加速率貫穿剩余發(fā)酵過(guò)程.6、整個(gè)甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)一共參加接近740ml每升發(fā)酵液初始體積,持續(xù)差不多70ho然而,這個(gè)針對(duì)不同的蛋白質(zhì)可能會(huì)有一些變化.在甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)中細(xì)胞濃度會(huì)最終增加到350-450g/L濕細(xì)胞.記住這些因?yàn)榇蠖鄶?shù)的發(fā)酵都在進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)模式,最終的發(fā)酵體積會(huì)接近于2倍初始發(fā)酵體積.Muts型畢赤酵母菌株的發(fā)酵：由于Muts型培養(yǎng)物代謝甲醇不充

14、分,他們的氧氣消耗就非常低.因此,你不能利用DO值來(lái)估量培養(yǎng).在Muts型菌株的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵中,調(diào)整甲醇流加速率來(lái)保持培養(yǎng)基中的不超過(guò)0.3%可以由氣象色譜分析來(lái)確定的過(guò)量甲醇.當(dāng)氣象色譜分析保證甲醇維持在無(wú)毒害水平,我們?cè)谟薪?jīng)驗(yàn)的指導(dǎo)下來(lái)進(jìn)行Muts型菌株的蛋白質(zhì)的表達(dá).氣象色譜分析對(duì)于分析和優(yōu)化Muts型重組菌株的生長(zhǎng)非常有幫助.甲醇補(bǔ)料培養(yǎng),接上Muts型菌株的甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)Muts型菌株的甘油批式培養(yǎng)和甘油補(bǔ)料培養(yǎng)這兩個(gè)階段根據(jù)Mut+型菌株所描述的發(fā)酵.Mut+型和Muts型在甲醇誘導(dǎo)階段的區(qū)別主要是方法和培養(yǎng)過(guò)程中甲醇流加的總量.1、在開(kāi)始階段流以1ml/h每升初始發(fā)酵液體積的速率流加每

15、升含12mlPTM1根底鹽類(lèi)的甲醇2h.然后每30min增加10%直到3ml/h的速率,以此速率保持整個(gè)發(fā)酵過(guò)程.2、發(fā)酵在甲醇誘導(dǎo)約100h后放罐.時(shí)間可能因蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)化而變化.細(xì)胞的成熟與衰退:簡(jiǎn)介：方法和設(shè)備不完全的列在下面.細(xì)胞的總量或上清液的體積將會(huì)決定你需要哪種設(shè)備.收獲細(xì)胞和上清液：在小型發(fā)酵罐1-10L中,培養(yǎng)物可以被到離心管500-1000ml中,再到離心管中將細(xì)胞從上清液中別離出來(lái).在大型發(fā)酵罐中,大型的月I過(guò)濾單元微孔或Sharples離心機(jī)可用于將細(xì)胞從上清液中別離出來(lái).最適宜的方法依賴(lài)于你需要細(xì)胞還是上清液作為你想要表達(dá)的蛋白質(zhì)的來(lái)源和你可以利用到什么.上清液可以直接裝載到適當(dāng)?shù)恼魞?chǔ)塔中或通過(guò)超濾來(lái)濃縮.細(xì)胞的衰亡：我們建議用玻璃粉來(lái)進(jìn)行細(xì)胞破碎.這個(gè)方法對(duì)于大量的細(xì)胞來(lái)說(shuō)可能顯得繁冗.遂于大量的細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)用乳化技術(shù)效果很好.French式壓碎細(xì)胞看上去