雌激素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中LRP16基因表達(dá)及其意義

1、雌激素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中LRP16基因表達(dá)及其意義 作者：孟元光，韓為東，黃柯，伍志強(qiáng)，趙亞力，母義明，宋磊 【關(guān)鍵詞】 LRP16基因；雌激素；Ishikawa細(xì)胞；EExpression regulation of LRP16 gene by 17estradiol and its significance in human endometrial cancer Ishikawa cells【Abstract】 AIM: To explore the regulation of LRP16 gene expression by 17estradiol (E2) in ER

2、positive human endometrial cancer Ishikawa cell line, and to investigate the effect of LRP16 overexpression on the proliferative potential and invasive growth of Ishikawa and the possible molecular mechanism. METHODS: The LRP16 mRNA level in Ishiwaka cells was determined by Northern blot analysis. T

3、he relative luciferase activity was measured using Dualluciferase reporter assay system. The effect of LRP16 overexpression on Ishiwaka proliferation was examined by the Trypan Blue exclusion method. The invasiveness of Ishikawa was evaluated by using the Matrigelcoated Transwell assay. The protein

4、levels in Ishikawa were determined by Western blot analysis. In addition, the Ecadherin mRNA level was also examined by Nothern blot. RESULTS: 17E2 induced an increase in LRP16 mRNA levels in Ishikawa cells, whereas, its pure antagonist, ICI 182 780 reduced the LRP16 mRNA level. Ectopic ER transfect

5、ion in Ishikawa increased the expression of LRP16 gene. The significant increase of the relative luciferase activity in Ishikawa cells cotransfected by pGL3S5 and ER plasmids was observed compared with that in the control cells transfected by pGL3S5 alone. Stimulative effect of LRP16 overexpression

6、on the proliferation of Ishikawa cells was not observed in this study. Thirtypersent increase of the invasive capacity was observed in Ishikawa cells with LRP16 overexpression. The mRNA and protein levels of Ecadherin gene was nearly 3fold decreased in Ishikawa cells with the overexpression of LRP16

7、, while the protein levels of MMP2, MMP9 and CD44 were not different between LRP16overexpressed Ishikawa cells and the control cells. CONCLUSION: Estrogen upregulated the LRP16 mRNA level by activation of ER and the LRP16 expression was dependent on the estrogen in ERpositive endometrial cancer cell

8、s. Upregulation of LRP16 did not promote the proliferation of the endometrial cancer cells, but increased its invasive potential possibly by suppressing the Ecadherin expression level.【Keywords】 LRP16; estrogen; Ishikawa; Ecadherin; endometrial carcinoma【摘要】 目的： 探討子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中雌激素（E2）對(duì)LRP16基因表達(dá)的調(diào)

9、控作用，LRP16基因過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖及侵襲生長能力的影響以及可能的分子機(jī)制. 方法： 采用Northern blot方法檢測(cè)細(xì)胞中LRP16基因mRNA表達(dá)水平. 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性. 胎盤藍(lán)死活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法觀察LRP16過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖的影響，Matrigel包被的Transwell方法觀察LRP16 過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞侵襲生長能力的影響. Western blot方法檢測(cè)Ishikawa細(xì)胞中的蛋白水平. 結(jié)果： 雌二醇誘導(dǎo)了Ishikawa細(xì)胞中LRP16基因mRNA水平表達(dá)上調(diào)；而ICI 182 780則Ishikawa細(xì)胞中

10、LRP16 mRNA水平下調(diào). 增加ER表達(dá)量促使Ishikawa細(xì)胞中LRP16基因上調(diào). pGL3S5與ER共轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性較單純pGL3S5轉(zhuǎn)染組細(xì)胞升高30倍. 我們沒有觀察到LRP16基因過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞的促增殖效應(yīng). Transwell結(jié)果顯示LRP16基因過表達(dá)Ishikawa細(xì)胞的侵襲率較對(duì)照組細(xì)胞增加了30%. LRP16基因過表達(dá)的Ishikawa細(xì)胞中E鈣粘合素的mRNA以及蛋白水平較對(duì)照組細(xì)胞下調(diào)了3倍，而沒有檢測(cè)到MMP2，MMP9以及CD44蛋白水平的變化. 結(jié)論： 我結(jié)果表明E2通過激活ER上調(diào)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞

11、中LRP16基因mRNA水平，LRP16表達(dá)水平依賴于雌激素. LRP16基因表達(dá)上調(diào)沒有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，但可能通過抑制E鈣粘合素表達(dá)水平增加了細(xì)胞的侵襲能力.【關(guān)鍵詞】 LRP16基因；雌激素；Ishikawa細(xì)胞；E鈣粘合素；子宮內(nèi)膜癌【中圖號(hào)】 Q78；Q250引言既往研究結(jié)果證實(shí)LRP16是一個(gè)雌激素（E2）反應(yīng)性基因，E2通過其受體（ER）上調(diào)LRP16基因的表達(dá)，LRP16基因過表達(dá)促進(jìn)內(nèi)源性ER陽性的乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖，而抑制其表達(dá)則限制MCF7細(xì)胞的增殖，并且限制了MCF7細(xì)胞對(duì)E2的反應(yīng)性增殖能力1-4. 我們?cè)贗shikawa子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中探討了E2對(duì)LRP

12、16基因的表達(dá)調(diào)控效應(yīng)以及LRP16表達(dá)對(duì)E2活性的依賴性，并且研究了LRP16基因過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞增殖以及侵襲生長的影響，觀察到LRP16基因表達(dá)依賴于E2活性，該基因過表達(dá)通過下調(diào)E鈣粘合素（Ecadherin）促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞侵襲生長.1材料和方法1.1材料Matrigel膠、Ecardherin鼠抗人單抗購于美國BD公司，G418，24Transwell模型系統(tǒng)購于美國Coster公司、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)、小牛血清白蛋白BSA以及17estradiol購于美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FCS）購于美國Hyclone公司；兔抗

13、MMP2，MMP9，CD44，鼠抗Ecadherin以及actin抗體購于美國Sata Cruz公司；L15以及無酚紅DMEM培養(yǎng)基購于協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所細(xì)胞中心；去除E2血清由我室自行制備；32PdCTP購自北京亞輝公司；探針標(biāo)記試劑盒購自美國Promega公司；ER與LRP16真核表達(dá)載體由我室保存. ICI 182 780由軍科院葉棋濃教授提供；Superfect轉(zhuǎn)染試劑購自Qiagen公司； LRP16基因啟動(dòng)子（-676至-24 bp）驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)道子pGL3S5參見文獻(xiàn)3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)Ishikawa，T47D以及MDAMB231由我室保存，培養(yǎng)參照ATCC方法. 去除E2培

14、養(yǎng)至少3 d.1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞篩選10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞至覆蓋率達(dá)50%，Superfect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染LRP16真核表達(dá)載體pcDNA3.1LRP16或?qū)φ蛰d體pcDNA3.1，轉(zhuǎn)染方法參照說明書. 48 h后加G418（800 mg/L）篩選培養(yǎng)14 d，200 mg/L維持培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)與分子學(xué)實(shí)驗(yàn). Ishikawa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ER后48 h提取總RNA進(jìn)行Norhtern blot分析.1.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用胎盤藍(lán)死活細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評(píng)估細(xì)胞增殖狀況. 將G418篩選的Ishikawa細(xì)胞消化傳至24孔板，每孔1×104，每組3個(gè)平行孔. 每24 h計(jì)數(shù)，之

15、前1×PBS洗兩次，胎盤藍(lán)染色. 共計(jì)7 d. 該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)4條件下解凍Matrigel過夜，雙無DMEM按15稀釋Matrigel，鋪于Transwell小室上室，并置于37放置0.5 h使基底膜膠凝固. 每個(gè)小室接種1×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行皿，并加雙無DMEM 200 L. 下室內(nèi)加入350 mL 100 g/L FCS的培養(yǎng)基和Fibronectin (16 g/室). 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定下小室細(xì)胞，HE染色，光學(xué)顯微鏡下(×200)隨機(jī)選取15個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，算出每個(gè)視野的平均值. 上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.1.6Nor

16、thern blotTriZol提取總RNA，每個(gè)樣品取20 g上樣于12 g/L的甲醛變性凝膠，100 V電泳1.5 h，毛細(xì)管法將核酸轉(zhuǎn)移至尼龍膜，80烤膜2 h. 雜交后的尼龍膜用4×SSC/5 g/L SDS漂洗30 min，置-80放射自顯影. 具體過程參見文獻(xiàn)5.1.7Western blot40 g細(xì)胞總蛋白質(zhì)上樣于100 g/L的SDSPAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后分別與抗人MMP2（1400），MMP9（1400），CD44（1400），Ecadherin（1200）及actin（1500）孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗雜交，放射自顯影.2結(jié)果2.1LRP16基因在Is

17、hikawa細(xì)胞中的表達(dá)水平依賴于E2活性采用Northern blot方法分析了E2對(duì)Ishikawa細(xì)胞中LRP16表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖1A所示，E2刺激了細(xì)胞中LRP16 mRNA表達(dá)水平的上調(diào)；為觀察抑制ER活性對(duì)Ishikawa細(xì)胞中LRP16表達(dá)的影響，我們采用純的雌激素抑制劑ICI 182 780培養(yǎng)細(xì)胞，觀察到LRP16 mRNA水平顯著下調(diào)（圖1B），該結(jié)果表明E2刺激Ishikawa細(xì)胞中LRP16表達(dá)，而抑制E2活性則下調(diào)LRP16表達(dá).為觀察ER表達(dá)水平對(duì)LRP16表達(dá)的影響，我們將ER載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)細(xì)胞中LRP16 mRNA表

18、達(dá)量，結(jié)果如圖1C示，外源性轉(zhuǎn)染ER明顯提高了Ishikawa細(xì)胞中ER的表達(dá)量，同時(shí)上調(diào)了LRP16基因的表達(dá)水平；為進(jìn)一步驗(yàn)證ER是否通過對(duì)LRP16基因轉(zhuǎn)激活上調(diào)其表達(dá)，我們采用不同劑量的ER表達(dá)載體與LRP16啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)道子pGLS5共轉(zhuǎn)染T47D, Ishikawa以及MDAMB231細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性，結(jié)果如圖1D示，隨細(xì)胞中ER含量的增高LRP16啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，這一結(jié)果明確證實(shí)ER具有刺激LRP16轉(zhuǎn)激活效應(yīng)，并且該效應(yīng)依賴于ER的含量. 以上結(jié)果表明LRP16的轉(zhuǎn)激活依賴于E2的活性.圖1LRP16基因表達(dá)依賴于雌激素活性（略）2.2LRP16基因過表達(dá)促

19、進(jìn)了Ishikawa細(xì)胞的侵襲生長，但沒有促進(jìn)其增殖為檢測(cè)LRP16基因過表達(dá)對(duì)Ishikawa細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，我們篩選了LRP16過表達(dá)的Ishikawa細(xì)胞，首先進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明LRP16過表達(dá)沒有顯著刺激Ishikawa細(xì)胞的增殖（未顯示結(jié)果）；接著我們采用改良的Transwell方法檢測(cè)了LRP16過表達(dá)Ishikawa細(xì)胞的侵襲生長能力，結(jié)果如圖2示， LRP16過表達(dá)ishikawa細(xì)胞穿過生物基底膜的數(shù)量比與對(duì)照細(xì)胞增多30%（P<0.05），表明LRP16過表達(dá)顯著提高了Ishikawa細(xì)胞的侵襲能力.2.3LRP16基因過表達(dá)下調(diào)了Ishikaw

20、a細(xì)胞中Ecadherin的表達(dá)水平為進(jìn)一步探討LRP16促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞侵襲生長可能的分子學(xué)機(jī)制，我們采用Western blot方法檢測(cè)了LRP16過表達(dá)與對(duì)照Ishikawa細(xì)胞中MMP2，MMP9，CD44以及Ecadherin基因的蛋白水平，結(jié)果顯示LRP16過表達(dá)細(xì)胞中只有Ecadherin蛋白水平顯著下調(diào)；進(jìn)而我們采用Northern blot方法檢測(cè)了兩個(gè)細(xì)胞中Ecadherin基因mRNA水平的差異，結(jié)果顯示LRP16過表達(dá)明顯下調(diào)了Ishikawa細(xì)胞中Ecadherin基因的轉(zhuǎn)錄本（圖3）.圖2LRP16基因過表達(dá)促進(jìn)了Ishikawa細(xì)胞的侵襲生長（略）圖3LR

21、P16過表達(dá)誘導(dǎo)了Ishikawa細(xì)胞中Ecadherin基因的mRNA與蛋白水平（略）3討論子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，雌激素對(duì)正常子宮內(nèi)膜的過度刺激以及雌激素受體的過度表達(dá)是導(dǎo)致子宮內(nèi)癌發(fā)生與進(jìn)展的主要因素，越來越多的研究資料證實(shí)雌激素通過其下游靶基因?qū)е伦訉m內(nèi)膜癌的發(fā)生與進(jìn)展6，故識(shí)別新的雌激素靶基因并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究對(duì)從分子水平研究子宮內(nèi)膜癌有重要的科學(xué)意義與潛在的診斷治療價(jià)值.LRP16是本研究組識(shí)別的一個(gè)雌激素反應(yīng)性基因，既往研究證實(shí)雌激素通過其受體（ER）上調(diào)LRP16基因轉(zhuǎn)錄，該基因過表達(dá)促進(jìn)內(nèi)源性ER陽性的乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖，分子機(jī)制涉及了G1/S期周期轉(zhuǎn)換

22、蛋白cyclin E與cyclin D1的表達(dá)上調(diào)1-2. 但LRP16在內(nèi)源性ER陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的研究目前尚不清楚. 本項(xiàng)目以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa為模式細(xì)胞，重點(diǎn)探討LRP16對(duì)雌激素的反應(yīng)性以及LRP16過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的分子學(xué)機(jī)制. 結(jié)果顯示雌激素刺激LRP16基因在Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)，而抑制雌激素活性下調(diào)了LRP16基因表達(dá)，表明LRP16表達(dá)對(duì)雌激素活性的依賴性，進(jìn)一步證實(shí)LRP16是一個(gè)雌激素反應(yīng)性靶基因，同時(shí)證明LRP16表達(dá)水平可以反映雌激素的活性狀態(tài)以及雌激素信號(hào)通路的活躍程度.子宮內(nèi)膜癌的侵襲生長是瘤細(xì)胞重要的惡性表征，其分子學(xué)機(jī)制

23、主要涉及了MMP2，MMP9，CD44以及Ecadherin的表達(dá)下調(diào)7-9. 我們觀察到LRP16過表達(dá)顯著增加了Ishikawa細(xì)胞的體外侵襲生長能力，分子學(xué)研究結(jié)果顯示LRP16過表達(dá)下調(diào)了Ecadherin基因的表達(dá)，初步表明LRP16促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞侵襲生長的分子機(jī)制主要涉及了Ecadherin表達(dá)水平的變化.總之，通過本項(xiàng)目研究我們認(rèn)識(shí)到雌激素調(diào)控的靶基因LRP16在子宮內(nèi)膜的發(fā)生與進(jìn)展中可能有重要作用，進(jìn)一步的臨床病理學(xué)研究結(jié)果將充分證實(shí)這一論點(diǎn).【參考文獻(xiàn)】1 Han WD, Mu YM, Lu XC, et al. Upregulation of LRP16 mRNA

24、 by 17estradiol through activation of estrogen receptor (ER), but not estrogen receptor (ER), and promotes human breast cancer MCF7 cell proliferation: A preliminary reportJ. Endoc Relat Cancer, 2003, 10(3):215-222.2 韓為東，李琦，趙亞力, 等. 小干擾RNA抑制LRP16基因表達(dá)限制了MCF7乳腺癌細(xì)胞增殖J. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2005, 21(1):113-119

25、.3 Zhao YL, Han WD, Li Q, et al. Mechanism of transcriptional regulation of LRP16 gene expression by 17 estradiol in MCF7 human breast cancer cellsJ. J Mol Endocrinol， 2005, 34(1):77-89.4 趙亞力, 韓為東, 母義明,等. 雌激素通過ER與Sp1的相互作用上調(diào)LRP16基因的轉(zhuǎn)錄J. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué), 2004, 20(3):99-105.5 Xu Q, Konta T, Furusu A, Nakayama K, et al. Transcriptional induction of mitogenactivated protein kinase phosphatase